辣椒果实果形基因CaFS1及与其连锁的KASP分子标记及其引物、获得方法和应用

本发明属于辣椒育种和分子生物学领域，更具体地涉及一种辣椒果形基因cafs1，及与该基因紧密相关的snp分子标记及引物(kasp)，同时还涉及它们在预测辣椒果形变化及分子辅助育种中的应用。

背景技术：

1、辣椒(capsicum annuum l.)为茄科辣椒属，是中国最重要的蔬菜作物之一。果实是辣椒最主要的经济产出品，因其营养丰富，产业链长，经济附加值高，已成为我国的重要作物。果实形状是作物栽培驯化选择过程中最主要的选择性状之一，辣椒野生种果实极小，但在驯化和改良过程中现代栽培辣椒的果实逐渐变大，且演变出丰富多样的形状。对于以鲜果为食用器官的辣椒等蔬菜作物，果实形状更是重要的商品性状，因为果实的形状和大小不仅影响农作物的产量和质量，还影响着消费者的消费偏好、包装需求和市场价值。目前果实形状仍是中国育种家在辣椒育种方案上非常关注的重要性状。

2、辣椒果形性状由数量性状位点(quantitative trait locus，qtl)调控，是分子标记辅助育种(mas)的主要靶标。虽然辣椒存在基因组大、遗传连锁图谱分子标记饱和度低，qtl基因挖掘费时费力问题，但辣椒基因组信息的完善及分子标记技术的发展极大地促进了qtl克隆及功能分析。研究者通过自然群体或杂交群体已经鉴定到许多辣椒果实相关qtls位点。比如，鉴定到16个snp位点与果重关联，其中7个snp位于已知果重基因上，如stylosa、fasciated、wuschel和clavata1等。在果肉厚度方面，鉴定到的qpt.iivr-2.1，qpt.iivr-3.1、ftd2.1等qtls位点，并发现qtl nlolg25.1与子房数相关。而在lcn1.1处鉴定到控制辣椒心室相关基因cabrx，沉默cabrx可以显著减少心室数量，并且影响了花和心室相关基因的表达。fs3.1和fs10.12被发现是果长最强主效qtls，分别能够解释67％和44％的遗传效应。尽管辣椒果实性状研究虽然已经发现了一些有关的基因qtl，但这些调控因子的作用模式仍然知之甚少，对于它们的应用依旧是局限和低效的。

3、因此，探究辣椒重要农艺性状如果形的关键基因或qtl功能，并开发果形相关的分子标记，对于辣椒分子育种技术体系的建立有着重要的推动意义。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种与辣椒果形基因cafs1连锁的snp分子标记(kasp标记)。为辣椒果实果形的筛选，鉴定和辅助筛选辣椒长圆果实，以及辣椒果实果形的育种等提供新的途径。

2、为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

3、第一方面，本发明提供一种与辣椒果实果形基因cafs1连锁的kasp分子标记，以辣椒zunla-1的基因为参考基因，在为辣椒10号染色体上第14853470个碱基处的单核苷酸多态性，此处发生了碱基c到t的替换。

4、上述的与辣椒果实果形基因cafs1连锁的kasp分子标记，优选的，其核苷酸序列如seq id no：2所示。

5、第二方面，本发明提供一种鉴定所述kasp分子标记的引物，包括：

6、正向引物1：gaaggtgaccaagttcatgcttgttttaacagaaactggtgttttc；

7、正向引物2：gaaggtcggagtcaacggatttgttttaacagaaactggtgttttt；

8、反向引物：aaaaagtgctaacaggacatcacg。

9、两个正向引物分别连接不同的荧光接头序列，正向引物1中与fam荧光匹配的接头序列为gaaggtgaccaagttcatgct，正向引物2中与hex荧光匹配的接头序列为gaaggtcggagtcaacggatt。

10、第三方面，本发明提供一种所述kasp分子标记的筛选方法，包括以下步骤：

11、(1)对辣椒材料进行的重测序，根据重测序结果对辣椒果形性状行进行了全基因组关联分析，在此基础上利用辣椒长果的高代自交系为父本，辣椒圆果的高代自交系为母本，杂交构建f2群体；

12、(2)对所述f2群体进行果形表型鉴定，采用混池分离分析群体定位法分别获得长果混池和圆果混池，并进行rna-seq测序，对测序结果进行生物信息学分析后获得与辣椒果实果形连锁的染色体候选区域；

13、(3)对所述染色体候选区域中的单碱基的替换/插入/缺失开发分子标记技术缩小候选区间，最终获得与果形基因cafs1紧密连锁的kasp分子标记。

14、第四方面，本发明提供一种所述kasp分子标记或所述的引物在鉴定辣椒长果和圆果类型或分子辅助育种中的应用。有利于辣椒果实果形基因的快速鉴定和选育，且为克隆控制果形的主效基因，为研究果实果形变化的调控机制奠定基础。

15、上述的应用，优选的，其应用的方法如下：

16、s1：提取辣椒待测样品dna作为模板；

17、s2：加入所述的引物进行pcr扩增；

18、s3：利用kasp试剂进行分型，读取分型结果，蓝色为圆果显性fam，绿色为长果隐性hex，红色为中间型果实杂合heterozygote。

19、优选的，使用定量pcr设备进行parms pcr扩增；荧光基团和对应荧光淬灭基团距离较近时，荧光基团发出的荧光，会被淬灭基团吸收，发射出更长波长的荧光，或者放出热量。此时在此荧光对应的波长内检测不到该基团荧光信号。一旦二者分离，则荧光信号可被检测到。parms采用了fret原理来检测fam以及hex荧光引物的扩增信号，对应的等位基因发生扩增时，将出现对应的荧光信号。

20、优选的，pcr扩增程序为：preincubation 94℃900s；94℃20s，78℃10s，td 62℃，0cyc-＞57(-0℃)，10个循环；94℃20s，57℃60s，35个循环；cooling 37℃30s。

21、第五方面，本发明提供一种辣椒果实果形基因cafs1，其编码区的cds核苷酸序列如seq id no：1所示。

22、第六方面，本发明提供一种辣椒果实果形基因cafs1在调控辣椒或番茄果形中的应用。

23、上述的应用，优选的，在辣椒中沉默cafs1基因，培育短小果形的辣椒品种。

24、优选的，在番茄过表达cafs1基因，培育长果番茄品种。

25、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

26、1、本发明筛选到一个kasp分子标记可以直接用于辣椒果实果形的鉴定，进而依赖该分子标记进行辅助育种，能够有效的解决常规育种周期长，易受到环境影响的问题，在辣椒果实果形育种实践及果形变化和调控机制研究上均具有重要意义；利用该标记对f2群体90个随机抽样的单株进行基因型鉴定，符合率达到100％，该结果不仅有助于辣椒果实果形鉴别及辅助育种，且为果形基因的图位克隆及解析辣椒果形变化的分子机理奠定了基础。

27、2、通过早期利用该分子标记可以快速筛选到满意的植株，有效的减小了种植规模，减少了后期鉴定的工作量，提高了选择的效率和准确性，对研究果实颜色的形成机制具有重大的意义。