一种用于检测霍乱弧菌核酸的引物探针组合及试剂盒的制作方法

本技术涉及基因检测，特别是涉及一种用于检测霍乱弧菌核酸的引物探针组合及试剂盒。

背景技术：

1、霍乱是由霍乱弧菌(vibrio cholerae)引起的急性肠道传染病，具有发病急、传播快、波及面广的特点，是我国《传染病防治法》规定的两种甲类传染病之一，也是《国际卫生检疫条例》规定国际检疫的三种传染病之一。霍乱弧菌是革兰氏阴性菌，菌体短小呈逗点状，有单鞭毛、菌毛，部分有荚膜。根据霍乱弧菌o抗原的不同，霍乱弧菌可分出200个以上的o血清群，但仅发现o1群和o139群霍乱弧菌能引发霍乱。而非o1群霍乱弧菌或非o139群霍乱弧菌大量存在于自然界水生生态系统中偶尔引起腹泻，少数非o1群霍乱弧菌或非o139群霍乱弧菌会导致毒力增加。霍乱毒素是霍乱的主要致病因子，其他致病因子包括溶血素等，这些致病因子致病力强，易引起流行和暴发。因此，分型及对霍乱毒素、溶血素的检测对判断流行株、非流行株，判定疫情的严重程度，从而采取不同防制策略和措施有着重要作用。

2、根据中国疾病预防控制中心发布的《全国霍乱监测方案-2017》中推荐对霍乱弧菌o1和o139菌群进行分型，同时以霍乱毒素基因作为检测标准，且标准方法为荧光定量pcr法。但常规荧光定量pcr探针采用taqman的方法进行检测，然对于序列相似/相近、或引起症状相似的同源菌群，检测特异性效果不甚理想，尤其是对于多重扩增的试剂其更易引起非特异性扩增。因此，急需开发一种特异性效果好、灵敏度高、稳定性好的引物探针组合及试剂盒。

技术实现思路

1、本技术的目的在于提供一种用于检测霍乱弧菌核酸的引物探针组合及试剂盒，提高了检测的特异性、灵敏度和稳定性。具体技术方案如下：

2、本技术的第一方面提供了一种用于检测霍乱弧菌核酸的引物探针组合，其包括用于检测霍乱弧菌溶血素基因(hlya)的引物探针组合；其中，所述用于检测hlya的引物探针组合选自h1、h2和h3中的任一组合：

3、h1包括序列如seq id no:1所示的上游引物hf1、序列如seq id no:2所示的下游引物hr1、序列如seq id no:3所示的上游探针hp1-1和序列如seq id no:4所示的下游探针hp2-1；

4、h2包括序列如seq id no:5所示的上游引物hf2、序列如seq id no:6所示的下游引物hr2、序列如seq id no:7所示的上游探针hp1-2和序列如seq id no:8所示的下游探针hp2-2；

5、h3包括序列如seq id no:9所示的上游引物hf3、序列如seq id no:10所示的下游引物hr3、序列如seq id no:11所示的上游探针hp1-3和序列如seq id no:12所示的下游探针hp2-3。

6、本技术的第二方面提供了一种用于检测霍乱弧菌核酸的引物探针组合，其包括用于检测霍乱弧菌毒力基因(ctxa)的引物探针组合；其中，所述用于检测ctxa的引物探针组合选自c1和c2中的任一组合：

7、c1包括序列如seq id no:13所示的上游引物cf1、序列如seq id no:14所示的下游引物cr1、序列如seq id no:15所示的上游探针cp1-1和序列如seq id no:16所示的下游探针cp2-1；

8、c2包括序列如seq id no:17所示的上游引物cf2、序列如seq id no:18所示的下游引物cr2、序列如seq id no:19所示的上游探针cp1-2和序列如seq id no:20所示的下游探针cp2-2。

9、本技术第三方面提供了一种用于检测霍乱弧菌核酸的引物探针组合，其包括用于检测o1型霍乱弧菌o抗原基因(o1-rfb)的引物探针组合；其中，所述用于检测o1-rfb的引物探针组合选自o1-1和o1-2中的任一组合：

10、o1-1包括序列如seq id no:21所示的上游引物o1f1、序列如seq id no:22所示的下游引物o1r1、序列如seq id no:23所示的上游探针o1p1-1和序列如seq id no:24所示的下游探针o1p2-1；

11、o1-2包括序列如seq id no:25所示的上游引物o1f2、序列如seq id no:26所示的下游引物o1r2、序列如seq id no:27所示的上游探针o1p1-2和序列如seq id no:28所示的下游探针o1p2-2。

12、本技术第四方面提供了一种用于检测霍乱弧菌核酸的引物探针组合，其包括用于检测o139型霍乱弧菌o抗原基因(o139-rfb)的引物探针组合；其中，所述用于检测o139-rfb的引物探针组合选自o139-1和o139-2中的任一组合：

13、o139-1包括序列如seq id no:29所示的上游引物o139f1、序列如seq id no:30所示的下游引物o139r1、序列如seq id no:31所示的上游探针o139p1-1和序列如seq id no:32所示的下游探针o139p2-1；

14、o139-2包括序列如seq id no:33所示的上游引物o139f2序列如seq id no:34所示的下游引物o139r2、序列如seq id no:35所示的上游探针o139p1-2和序列如seq id no:36所示的下游探针o139p2-2。

15、本技术的第五方面提供了一种用于检测霍乱弧菌核酸的引物探针组合，其包括用于检测hlya的引物探针组合、用于检测ctxa的引物探针组合及用于检测o1-rfb的引物探针组合和用于检测o139-rfb的引物探针组合；

16、其中，所述用于检测hlya的引物探针组合选自h1、h2和h3中的任一组合：

17、h1包括序列如seq id no:1所示的上游引物hf1、序列如seq id no:2所示的下游引物hr1、序列如seq id no:3所示的上游探针hp1-1和序列如seq id no:4所示的下游探针hp2-1；

18、h2包括序列如seq id no:5所示的上游引物hf2、序列如seq id no:6所示的下游引物hr2、序列如seq id no:7所示的上游探针hp1-2和序列如seq id no:8所示的下游探针hp2-2；

19、h3包括序列如seq id no:9所示的上游引物hf3、序列如seq id no:10所示的下游引物hr3、序列如seq id no:11所示的上游探针hp1-3和序列如seq id no:12所示的下游探针hp2-3；

20、其中，所述用于检测ctxa的引物探针组合选自c1和c2中的任一组合：

21、c1包括序列如seq id no:13所示的上游引物cf1、序列如seq id no:14所示的下游引物cr1、序列如seq id no:15所示的上游探针cp1-1和序列如seq id no:16所示的下游探针cp2-1；

22、c2包括序列如seq id no:17所示的上游引物cf2、序列如seq id no:18所示的下游引物cr2、序列如seq id no:19所示的上游探针cp1-2和序列如seq id no:20所示的下游探针cp2-2；

23、其中，所述用于检测o1-rfb的引物探针组合选自o1-1和o1-2中的任一组合：

24、o1-1包括序列如seq id no:21所示的上游引物o1f1、序列如seq id no:22所示的下游引物o1r1、序列如seq id no:23所示的上游探针o1p1-1和序列如seq id no:24所示的下游探针o1p2-1；

25、o1-2包括序列如seq id no:25所示的上游引物o1f2、序列如seq id no:26所示的下游引物o1r2、序列如seq id no:27所示的上游探针o1p1-2和序列如seq id no:28所示的下游探针o1p2-2；

26、其中，所述用于检测o139-rfb的引物探针组合选自o139-1和o139-2中的任一组合：

27、o139-1包括序列如seq id no:29所示的上游引物o139f1、序列如seq id no:30所示的下游引物o139r1、序列如seq id no:31所示的上游探针o139p1-1和序列如seq id no:32所示的下游探针o139p2-1；

28、o139-2包括序列如seq id no:33所示的上游引物o139f2序列如seq id no:34所示的下游引物o139r2、序列如seq id no:35所示的上游探针o139p1-2和序列如seq id no:36所示的下游探针o139p2-2。

29、在本技术的一种实施方案中，所述用于检测hlya的引物探针组合选自h2，所述用于检测ctxa的引物探针组合选自c1，所述用于检测o1-rfb的引物探针组合选自o1-1，所述用于检测o139-rfb的引物探针组合选自o139-2。

30、在本技术的一种实施方案中，所述引物探针组合中上游探针的3’端均标记荧光报告基团，下游探针的5’端均标记荧光淬灭基团；其中，所述荧光报告基团选自fam、hex、texas、cy3、cy5、tamra、tet、joe、vic、ned和rox中的任意一种；所述荧光淬灭基团选自tamra、bhq1和dabcy中的任意一种。

31、在本技术的一种实施方案中，所述上游探针hp1-1、上游探针hp1-2、上游探针hp1-3的3’端各自独立地标记荧光报告基团fam，所述下游探针hp2-1、下游探针hp2-2、下游探针hp2-3的5’端各自独立地标记荧光淬灭基团bhq1；

32、所述上游探针cp1-1、上游探针cp1-2的3’端各自独立地标记荧光报告基团vic，所述下游探针cp2-1、下游探针cp2-2的5’端各自独立地标记荧光淬灭基团bhq1；

33、所述上游探针o1p1-1、上游探针o1p1-2的3’端各自独立地标记荧光报告基团rox，所述下游探针o1p2-1、下游探针o1p2-2的5’端各自独立地标记荧光淬灭基团bhq1；

34、所述上游探针o139p1-1、上游探针o139p1-2的3’端各自独立地标记荧光报告基团cy5，所述下游探针o139p2-1、下游探针o139p2-2的5’端各自独立地标记荧光淬灭基团bhq1。

35、本技术的第六方面提供了本技术第一方面至本技术第五方面所述的引物探针组合在制备用于检测霍乱弧菌核酸的试剂盒中的应用。

36、本技术的第七方面提供了一种用于检测霍乱弧菌核酸的试剂盒，所述试剂盒包括本技术第一方面至本技术第五方面所述的引物探针组合。

37、本技术的有益效果：

38、本技术提供了一种用于检测霍乱弧菌核酸的引物探针组合，分别选取hlya、ctxa、o1-rfb或o139-rfb的核酸序列的特异性保守区，设计特异性引物探针组合，能够对霍乱弧菌核酸精准检测，可防止漏检，与副溶血弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌等与霍乱弧菌具有相似感染症状的常见病原体无交叉反应。进一步地，本技术提供的用于检测霍乱弧菌核酸的试剂盒的特异性好、灵敏度高、稳定性好，操作简便，全程闭管检测，一管完成霍乱弧菌核酸检测，避免了由于样本间的交叉污染引起的假阳性和环境污染。

39、当然，实施本技术的任一产品或方法并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。