人源胶原蛋白的基因、该胶原蛋白的生产方法和检测方法与流程

本技术涉及生物工程领域，具体而言，涉及一种人源胶原蛋白的基因、该胶原蛋白的生产方法和检测方法。

背景技术：

1、人源胶原蛋白由于具备抗原性弱，利于细胞黏附，可诱导细胞增殖、分化，可为细胞长入胶原沉积和新血管形成提供支架，其降解产物也可为创面修复提供必须的氨基酸等优势，因而成为制备创面敷料、化妆品、组织工程、医疗器械等应用领域的重要材料。

2、胶原分子形成了一种特殊的超螺旋结构，由三条无链内氢键形成而仅受链间氢键支撑的多肽链组成。这种螺旋性的结构是以3个氨基酸残基为基本重复体的左手螺旋，这3个氨基酸残基通常为gly-x-pro。gly对胶原蛋白中氢键的形成是必须的，它本身没有侧链，可以使胶原蛋白紧密堆积。在更高级的结构层次上，胶原超螺旋会进一步缔合成为胶原原纤维。在生物体中，胶原蛋白的合成和修饰从原胶原开始，经历了羟基化、糖基化、相互交联等诸多化学变化，受到了多种生物酶的复杂调控。原胶原除了含有胶原链之外，还含有球状的头部和尾部。没有这些头部和尾部，胶原链就不会折叠成为正确的三螺旋，从而缺乏胶原蛋白的生物学活性。因此，按照原始基因序列制备的胶原蛋白不可能在体外自发的组织形成正确的空间结构。这样的困难严重阻碍了人源胶原蛋白的研发和生产；

3、生产胶原蛋白的传统方法是利用酸、碱、酶解法处理动物来源的组织，提取胶原蛋白衍生物。这些方法提取的胶原蛋白本身已经丧失了原本的生物学活性，无法应用于生物医学领域发挥真正的功能。随着现代生物技术的发展，人们不断尝试利用转基因技术，在动物、植物和微生物表达体系中制备重组人胶原蛋白，解决了传统提取工艺的诸多缺点。国外研究机构通过培育含人胶原蛋白基因的小鼠，得到了含有人胶原蛋白的乳汁，但是这样生产的成本过高，生产周期过长，无法投入大规模生产。

技术实现思路

1、本技术的内容部分用于以简要的形式介绍构思，这些构思将在后面的具体实施方式部分被详细描述。本技术的内容部分并不旨在标识要求保护的技术方案的关键特征或必要特征，也不旨在用于限制所要求的保护的技术方案的范围。

2、为了解决以上背景技术部分提到的技术问题，本技术的第一目的提供了一种人源胶原蛋白的基因，其特征在于，该基因序列具有序列表中seqid：no.1所示的核苷酸序列。

3、本技术的第二目的提供了一种源胶原蛋白的生产方法，包括以下步骤：大肠杆菌基因工程菌的构建；大肠杆菌基因工程菌的发酵培养；重组人源胶原蛋白的诱导和表达；重组人源胶原蛋白的纯化。

4、进一步地，所述大肠杆菌基因工程菌的构建的方法包括：优化选择人的ⅲ型胶原蛋白基因的dna片段，并合成重组质粒；将重组基因转入大肠杆菌表达菌株中，筛选得到大肠杆菌基因工程菌。

5、进一步地，所述大肠杆菌基因工程菌的发酵培养的方法包括：在lb液体培养基中加0.1％50μg/ml卡那kana抗生素，挑取单菌落，混匀置于37℃220rpm摇床中培养12h；在lb液体培养基中加入0.1％50μg/ml卡那kana抗生素，再加入1.0％的过夜培养的菌液，置于37℃、220rpm摇床中培养，培养至进入对数生长期测定od600值为0.4-0.6后，加入诱导剂iptg诱导，诱导条件为低温16℃、220rpm诱导24h。

6、进一步地，所述重组人源胶原蛋白的纯化的方法包括：用tris缓冲液重悬细菌，超声破碎，离心收集上清液；利用镍离子亲和柱从上清液中纯化得到重组人源胶原蛋白。

7、本技术的第三目的是提供一种人源胶原蛋白的检测方法，包括以下步骤：

8、对人源胶原蛋白的进行mtt实验，获取mtt实验结果；对人源胶原蛋白的进行细胞划痕实验，获取细胞划痕实验结果；对人源胶原蛋白的进行细胞粘附性测定和相对粘附性计算，获取计算结果。

9、进一步地，对人源胶原蛋白的进行mtt实验，获取mtt实验结果的方法包括：

10、将balb/3t3细胞于37℃，5％co2细胞培养箱中培养，每天在倒置显微镜下观察细胞密度及状态。当细胞生长至培养瓶的80-90％时进行细胞传代或细胞接种。使用完全培养基，将细胞以3×103个/孔种于96孔板，每孔100μl，设置四个复孔，于37℃、5％二氧化碳条件下培养24小时，然后换成维持培养液进行饥饿处理24小时；弃去维持培养液，分别加入100μl维持培养基配制的重组胶原蛋白，终浓度为0mg/ml、0.01mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml。于37℃、5％二氧化碳条件下培养72小时。空白对照组只加入维持培养基；每孔加入mtt溶液10μl，于37℃、5％二氧化碳条件下培养4小时。小心吸弃孔中的上清，向每孔中加入100μldmso，充分吹打混匀后放入酶标仪，在波长570nm处测定吸光值，获取mtt实验结果。

11、进一步地，对人源胶原蛋白的进行细胞划痕实验，获取细胞划痕实验结果的方法包括：

12、用marker笔在6孔板背后每孔纵向划三条线做记号。按每孔约10×105个种细胞。目标为培养24h后能达到95-100％汇合状态；细胞培养24h后，用10μl枪头比着直尺垂直对准孔板向下轻推纵向划线形成划痕，用d-pbs漂洗细胞3次，去除划掉的细胞，分别在6个孔中加入2ml维持培养基配制的重组胶原蛋白，终浓度为0mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml。空白对照组只加入维持培养基；在37℃，5％co2培养箱培养，于0h、24h后，以横向和纵向划线的交点为核心，在40倍显微镜下拍照，每孔获得9个部位的照片；测量划痕区面积，通过固定划痕区移行细胞的总面积除以固定划痕区初始面积，计算每组细胞迁移率；获取细胞划痕实验结果。

13、进一步地，对人源胶原蛋白的进行细胞粘附性测定和相对粘附性计算，获取计算结果的方法包括：向96孔板内分别加入100μl重组胶原蛋白样品；，在37℃，5％co2培养箱中孵育4h。从孔中除去多余的d-pbs包被溶液，加入100μl0.5％bsa-pbs溶液，37℃，5％co2培养箱中孵育1h。移除孔内液体后，用d-pbs洗涤三次，弃除清洗液，用封口膜密封后置于4℃备用。使用前将细胞板放置培养箱中回温；将balb/3t3细胞于37℃，5％co2细胞培养箱中培养，每天在倒置显微镜下观察细胞密度及状态。当细胞生长至培养瓶的80-90％时进行细胞传代或细胞接种。使用已经与hoechst33342荧光染色剂预混合的完全培养基，将细胞以5×104个/孔种于96孔板，每孔100μl，设置三个复孔，用锡纸覆盖在37℃，5％co2孵育。孵育时间为1h；离心前每个样品孔分别进行荧光拍照。拍摄完后每个孔用250μl d-pbs填充以形成“反向弯月面”并用封口膜覆盖，倒置放置以250离心力离心5min，弃去封口膜并从孔中取出上清液。用d-pbs清洗1次后，再加入100μl d-pbs，对每个孔进行拍摄；计算并获取计算结果的。

14、本技术的有益效果在于：

15、1.本发明提供了一种新的胶原蛋白序列；

16、2.采用大肠杆菌表达系统，适于大规模放大，20小时即可完成一轮发酵，生产成本非常低，而且基因中的序列针对大肠杆菌表达系统进行了密码子优化，进一步提高了产量。