利用P450基因N-Z1为筛选标记、啶嘧磺隆为筛选剂的玉米遗传转化方法

(一)本发明属于生物工程，具体涉及一种利用细胞色素p450基因n-z1为筛选标记、啶嘧磺隆为筛选剂的玉米遗传转化方法。

背景技术：

0、(二)背景技术

1、玉米(zea mays l.)是一种重要的粮食作物、饲料作物和经济作物，是世界上很多地区的主要食物来源。从近几年玉米行业发展趋势来看，2016-2030年中国玉米产量的增长速度会有所下降，而玉米总消费量的增长速度将会明显超出产量的增长速度，国内供需缺口将会进一步扩大。若在保持种植面积不变的情况下，玉米生产方式的不断优化升级才能应对玉米供需缺口不断扩大的趋势。近100年来，玉米育种工作以自然种的杂交选育为主，虽然获得了一些优质的玉米品种，但是其育种工作量大、周期长、育种效率低。同时，种质资源匮乏、部分材料间杂交不亲和、生物间的生殖隔离等因素的存在，造成当前玉米品种同质化严重，影响了当代玉米育种工作的发展。以分子遗传学为基础的现代生物技术的发展与应用，尤其是转基因技术的应用，成功克服了远缘杂交不亲和的困难，将优良的基因导入到受体物种中，实现了育种性状的定向改变，有效地打破了物种间生殖隔离的障碍，丰富了材料的多样性。

2、自上世纪90年代以来，针对玉米的遗传转化研究快速发展。在玉米转化中，最常用的方法是根癌农杆菌介导的遗传转化。目前，玉米遗传转化筛选标记主要为抗生素抗性基因，如nptii、hpt等，以及抗草甘膦基因cp4 epsps、g2-epsps和g10-epsps，抗草铵膦基因bar和pat。然而，这些细菌来源的标记基因可能会影响环境中的菌群平衡，进而影响人类的健康，阻碍转基因玉米的实际应用。为了解决这一问题，从植物中分离可选择标记基因为玉米遗传转化提供了一种新的方法。

3、狗牙根是一种草坪草，可以耐受啶嘧磺隆除草剂。因其草茎内蛋白质含量较多，草质柔软、味淡、微甜，叶量丰富，适口性好，是马、牛、羊、兔、猪、家禽、草食性鱼类的优质青饲料。此外，狗牙根也是一种中药材，被认为具有解热利尿、舒筋活血的功能。因此，无论是动物还是人类，都与狗牙根经历了漫长的接触，未对人类健康造成影响。目前尚未有以从狗牙根中克隆的基因为筛选标记进行玉米遗传转化的报道。本发明创造性地将从狗牙根中克隆的抗啶嘧磺隆基因n-z1作为筛选标记，建立了一种基于啶嘧磺隆为筛选剂的玉米遗传转化体系。

技术实现思路

0、(三)
技术实现要素：

1、本发明的目的是克服现有技术中存在的缺陷，提供一种利用植物来源的细胞色素p450基因n-z1为筛选标记、啶嘧磺隆为筛选剂的玉米遗传转化方法，解决了细菌来源的标记基因可能会对环境中的菌群平衡造成影响，进而影响人类健康的问题。

2、本发明采用的技术方案是：

3、本发明提供一种利用细胞色素p450基因n-z1为筛选标记、啶嘧磺隆为筛选剂的玉米遗传转化方法，所述方法为：将含有细胞色素p450基因n-z1的转化载体转化农杆菌，再用农杆菌菌液侵染玉米幼胚，以啶嘧磺隆为筛选剂，筛选阳性转化体。所述以啶嘧磺隆为筛选剂是指用含n-z1基因的农杆菌菌液侵染玉米幼胚，侵染后的幼胚与农杆菌共培养，将共培养后的幼胚进行恢复培养，然后用含啶嘧磺隆的筛选培养基筛选恢复培养后的幼胚，得到抗性愈伤，抗性愈伤再生成幼苗，幼苗在含嘧啶磺隆的生根培养基中生根后得到转基因植株。

4、进一步，所述p450基因n-z1核苷酸序列如seq id no.1所示。

5、进一步，含有p450基因n-z1转化载体按如下方法构建：利用限制性内切酶xho i将原始pcambia1300载体的hygromycin基因去除，转入表达n-z1蛋白表达框和表达g10 epsps蛋白表达框，构建转化载体png。

6、进一步，表达n-z1蛋白表达框是将来源于水稻的actin1启动子、n-z1基因和终止子功能性连接，人工合成pactin1-n-z1-t35s片段；所述actin1启动子核苷酸序列如seq idno.2所示；所述终止子核苷酸序列如seq id no.3所示。

7、进一步，表达g10 epsps蛋白表达框是将来源于玉米polyubiquitin-1基因启动子zmubi-1、g10 epsps基因和终止子功能性连接，人工合成pzmubi-g10 epsps-t35s片段；所述启动子zmubi-1核苷酸序列如seq id no.5所示，g10 epsps基因核苷酸序列如seq idno.4所示；所述终止子核苷酸序列如seq id no.3所示。

8、本发明所述利用细胞色素p450基因n-z1为筛选标记、啶嘧磺隆为筛选剂的玉米遗传转化方法，包括以下步骤：

9、(1)构建含n-z1基因的表达载体，转化农杆菌；

10、(2)将步骤(1)得到的农杆菌在yep培养基上进行活化培养，得到活化后的农杆菌；

11、(3)将步骤(2)活化后的农杆菌在侵染液中悬浮混匀，得到农杆菌重悬液；

12、(4)将玉米幼胚浸泡在步骤(3)的农杆菌重悬液中，得到侵染后幼胚；

13、(5)将步骤(4)侵染后的幼胚接种于共培养培养基上，21-22℃暗培养3～5天，得到共培养后幼胚；

14、(6)将步骤(5)共培养后的幼胚转移到恢复培养基上，26-28℃暗培养10～14天，得到恢复培养后幼胚；

15、(7)将步骤(6)恢复培养后的幼胚转移到含啶嘧磺隆的筛选培养基上，26-28℃暗培养2～3周，得到抗性愈伤；

16、(8)将步骤(7)成活的抗性愈伤转移到再生培养基上，26-28℃暗培养10-14天，然后转移到新鲜的再生培养基中，25-26℃光照培养10-14天，得到幼苗；

17、(9)将步骤(8)再生的幼苗转移到含嘧啶磺隆的生根培养基上，25-26℃光照培养直到根发育完全，将生根后的再生苗移植到温室中生长繁种。

18、进一步，步骤(7)中啶嘧磺隆使用浓度为0.025-1mg/l，优选0.1mg/l和0.2mg/l，更优选0.1mg/l。

19、进一步，步骤(9)中，啶嘧磺隆使用浓度为0.025-0.08mg/l，优选0.025mg/l。

20、进一步，步骤(2)中，yep培养基组成：酵母提取物10g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠5g/l、琼脂15g/l、卡那霉素50mg/l、利福平25mg/l，溶剂为蒸馏水。

21、进一步，步骤(3)中，侵染液组成：ms基础盐4-5g/l、1000x n6维生素溶液0.5-1.5ml/l、水解酪蛋白0.5-1.5g/l、蔗糖60.5-76.5g/l、麦草畏3-7mg/l、葡糖糖30-42g/l、乙酰丁香酮30-50mg/l，溶剂为蒸馏水，ph5.2；更优选侵染液组成：ms基础盐4.33g/l、1000xn6维生素溶液1ml/l、水解酪蛋白1g/l、蔗糖68.5g/l、麦草畏5mg/l、葡糖糖36g/l、乙酰丁香酮40mg/l，溶剂为蒸馏水，ph5.2。

22、进一步，步骤(4)所述农杆菌重悬液的od660为0.4-0.6；所述幼胚为从幼穗上剥离获得的幼胚，所述幼穗为人工授粉8-10天(春、夏季)或10-13天(秋季)且幼胚最大直径为1.0-1.5mm时采摘的幼穗；所述浸泡时间为4-6min。

23、进一步，步骤(5)共培养培养基组成：ms基础盐4-5g/l、1000x n6维生素溶液0.5-1.5ml/l、mes(2-吗啉乙磺酸)0.3-0.7g/l、蔗糖15-25g/l、葡糖糖5-15g/l、半胱氨酸30-70mg/l、麦草畏2-4mg/l、乙酰丁香酮30-50mg/l、琼脂10-15g/l，溶剂为蒸馏水，ph5.8；更优选共培养培养基组成：ms基础盐4.33g/l、1000x n6维生素溶液1ml/l、mes(2-吗啉乙磺酸)0.5g/l、蔗糖20g/l、葡糖糖10g/l、半胱氨酸50mg/l、麦草畏3mg/l、乙酰丁香酮40mg/l、琼脂12g/l，溶剂为蒸馏水，ph5.8。

24、进一步，步骤(6)恢复培养基组成：ms基础盐4-5g/l、1000x n6维生素溶液0.5-1.5ml/l、mes(2-吗啉乙磺酸)0.5-1.5g/l、水解酪蛋白0.3-0.7g/l、脯氨酸1-1.76g/l、蔗糖25-35g/l、2,4-d 0.5-1.5mg/l、麦草畏1-3mg/l、酸水解酪蛋白50-150mg/l、特美汀150-250mg/l、硝酸银3-7mg/l、植物凝胶3-4g/l，溶剂为蒸馏水，ph5.8；更优选，恢复培养基组成：ms基础盐4.33g/l、1000x n6维生素溶液1ml/l、mes 1g/l、水解酪蛋白0.5g/l、脯氨酸1.38g/l、蔗糖30g/l、2,4-d 1mg/l、麦草畏1mg/l、酸水解酪蛋白100mg/l、特美汀200mg/l、硝酸银5mg/l、植物凝胶3.21g/l，溶剂为蒸馏水，ph5.8。

25、进一步，步骤(7)筛选培养基组成：ms基础盐4-5g/l、1000x n6维生素溶液0.5-1.5ml/l、mes(2-吗啉乙磺酸)0.3-0.7g/l、肌醇0.05-0.15g/l、蔗糖20-30g/l、麦草畏2-4mg/l、酸水解酪蛋白50-150mg/l、特美汀150-250mg/l、硝酸银3-7mg/l、啶嘧磺隆0.025-1mg/l、植物凝胶3-4g/l，溶剂为蒸馏水，ph5.8；更优选，筛选培养基组成：ms基础盐4.33g/l、1000x n6维生素溶液1ml/l、mes 0.5g/l、肌醇0.1g/l、蔗糖25g/l、麦草畏3mg/l、酸水解酪蛋白100mg/l、特美汀200mg/l、硝酸银5mg/l、啶嘧磺隆0.1mg/l、植物凝胶3.21g/l，溶剂为蒸馏水，ph5.8。

26、进一步，步骤(8)再生培养基组成：ms基础盐4-5g/l、1000x ms维生素溶液0.5-1.5ml/l、mes(2-吗啉乙磺酸)0.5-1.5g/l、肌醇0.05-0.15g/l、激动素0.3-0.7mg/l、嘧啶醇0.2-0.3mg/l、蔗糖20-30g/l、特美汀150-250mg/l、植物凝胶3-4g/l，溶剂为蒸馏水，ph5.8；更优选，再生培养基组成：ms基础盐4.33g/l、1000x ms维生素溶液1ml/l、mes1g/l、肌醇0.1g/l、激动素0.5mg/l、嘧啶醇0.25mg/l、蔗糖25g/l、特美汀200mg/l、植物凝胶3.21g/l，溶剂为蒸馏水，ph5.8。

27、进一步，步骤(9)生根培养基组成：ms基础盐1.8-2.5g/l、1000x ms维生素溶液0.5-1.5ml/l、肌醇0.05-0.15g/l、蔗糖15-25g/l、特美汀50-150mg/l、啶嘧磺隆0.025-0.08mg/l、植物凝胶3-4g/l，溶剂为蒸馏水，ph5.8；更优选，生根培养基组成：ms基础盐2.17g/l、1000x ms维生素溶液1ml/l、肌醇0.1g/l、蔗糖20g/l、特美汀100mg/l、啶嘧磺隆0.025mg/l、植物凝胶3.21g/l，溶剂为蒸馏水，ph5.8。

28、本发明采用g10 epsps速测试纸检测玉米阳性转化体。

29、与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

30、1、本发明首次提出在玉米转化过程中将植物来源的抗啶嘧磺隆基因n-z1作为筛选标记、啶嘧磺隆作为筛选剂加入筛选培养基和生根培养基中，成功进行玉米遗传转化，转化效率达到4.4％，转化效率和以草甘膦为筛选剂的转化效率相当，是一种安全高效的玉米转化筛选体系。

31、2、相较于细菌来源的传统抗生素抗性基因(nptii基因和hpt基因等)和除草剂抗性基因(bar基因、pat基因和epsps基因等)，本发明利用来源于植物的抗啶嘧磺隆基因n-z1为筛选标记，成功进行玉米遗传转化，拓宽了玉米遗传转化筛选标记基因范围，解决了细菌来源的筛选标记基因可能会对环境中的菌群平衡造成影响，进而影响人类健康的问题。

32、3、啶嘧磺隆为内吸型除草剂，本发明获得的转基因植株对啶嘧磺隆的耐受性较高，且其后代能稳定遗传，可直接开发成耐受啶嘧磺隆作物用于产品的开发。抗啶嘧磺隆性状不仅可在遗传转化阶段发挥作用，后续可用于田间杂草防治。同时，啶嘧磺隆与草甘膦轮换使用，可缓解草甘膦抗性杂草越来越多的问题。