一种促进番茄果实成熟的基因及其调控方法

本发明属于生物工程，涉及一种促进番茄果实成熟的基因及其调控方法，以及该促进番茄果实成熟的基因在促进番茄果实成熟及果实贮藏中的应用。

背景技术：

1、果实成熟是植物特有的生理特征，对于种子传播及植物的繁衍有着重要作用。同时对人类和动物的日常饮食也十分重要。番茄是我国广泛栽培的经济作物，其果实富含多种营养成分，是人类不可或缺的蔬菜。同时，番茄的生长周期较短，遗传背景清晰，目前已成为研究植物发育和果实成熟衰老的模式材料。此外，果实的成熟衰老生理是采后果蔬贮运的重要理论基础，调控成熟衰老是果实采后贮藏的核心技术，呼吸跃变型果实一旦发生呼吸跃变，成熟衰老便难以调控，推迟呼吸跃变过程从而延迟由此引发的衰老仍是目前采后贮藏的主要手段，调控呼吸跃变过程则是跃变型果实贮藏的难点和热点问题，但这一过程中仍有许多问题有待解决。

2、番茄果实类胡萝卜素的合成、叶绿素的降解、细胞壁降解、乙烯的合成与传导过程与果实成熟密切相关。番茄作为典型的呼吸跃变型果实，在果实成熟阶段，果实的颜色、质地、风味和口感等感官属性都发生显著的变化。目前，已经发现有多个基因控制果实的成熟，例如在s-腺苷-met合成酶1基因（slsams1）被激活表达后，s-腺苷-met积累，乙烯产量升高，果实成熟加速；细胞壁水解酶β-半乳糖苷酶基因dkgal1的表达量在果实成熟期间增加了25.01倍，且将该基因在番茄中过表达后果实硬度下降了23.83%；叶绿体金属蛋白酶l2敲除后叶绿体发育受阻，前期果实呈现白色，且类胡萝卜素和番茄红素的积累缓慢。寻找新的参与调控果实成熟的功能基因，依然是园艺领域的重要目标，有助于提高农作物的商业价值。

3、虽然番茄的栽培面积不断扩增，但在许多地区番茄的消费过程还是受到运输、贮藏、出售等因素的限制。8-9月为番茄成熟的高峰期，在此期间番茄供过于求，出售缓慢，导致很多番茄发霉、腐烂，影响番茄的质量，这不仅造成资源浪费，还给广大生产者带来经济上的损失，而选育早熟的番茄品种可以减少上述损失。早熟番茄的生长周期短，着色进程快，果实成熟提前，可以提早上市，这不仅可以提高番茄的商品性，还可以提高种植户的经济效益，调节淡季市场供应。

4、wrky家族基因最早是因其在植物的生物和非生物抗逆中发挥的作用被学者熟悉，是植物中较大的一类转录因子家族，拟南芥中有72个成员，水稻中有100个成员。wrky转录因子在结构上至少包含一个由60个氨基酸组成的保守dna结合域，即wrky domain，它是由n端高度保守的wrkygq序列和c端的锌指结构cx4-7cx22-23hxh/c组成，根据slwrky基因的wrky域比对，slwrky基因主要分为三个主要组(group i, groupⅱ-a, b, c, d, e, groupⅲ)wrky转录因子通过结合到靶基因启动子的w-box(c/ttgact/c)上，从而活化或者抑制靶基因的表达。

5、根据番茄的全基因组序列，huang等鉴定出81个slwrky基因，这些基因被分为三组，每组番茄wrky基因具有相似的基序组成，这些基因在不同的发育过程中以及对各种生物和非生物胁迫的响应中表现出不同的时空表达模式。在病原体胁迫期间，水杨酸反应途径的激活导致 wrky16转录因子上调，进而导致 sitrn1上调表达。番茄wrky转录因子也参与果实成熟过程， slwrky31和 slwrky23基因在果实成熟的裂果期和红熟期的表达量上调，通过vigs方法抑制 slwrky16、 slwrky17、 slwrky53和 slwrky54基因的表达后，延缓了番茄果实变红过程。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种促进番茄果实成熟的基因及其调控方法。

2、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种促进番茄果实成熟的基因，其特征在于：所述促进番茄果实成熟的基因的核苷酸序列如seq no.1所示。

3、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种促进番茄果实成熟的调控方法，包括下列步骤：

4、步骤1：首相将正向引物-f和反向引物-r用无菌ddh2o稀释至浓度为10 μm，pcr扩增50μl体系：32μl的ddh2o、10μl的sf buffer、2μl的正向引物-f、2μl的反向引物-r、1μl的dntp、1μl的sf dna polymerase；然后置于pcr仪中：95℃ 3 min；95℃ 10 s，55℃ 10 s，72℃ 45 s，35个循环；72℃ 7 min，4℃ ∞；

5、正向引物-f：5’-gagaacacgggggactctagaatggacaaaggatggggtctta-3’；

6、反向引物-r：5’-cttgtaatcggtaccctcgaggttccctgggaaactactagtgttatt-3’；

7、步骤2：把步骤1得到的pcr产物用dna产物纯化试剂盒纯化，然后取2 μl纯化产物进行琼脂糖凝胶电泳，检查产物纯化效果，浓度不低于5ng/μl时，进行下一步操作；

8、步骤3：将pbi121-flag质粒进行双酶切，然后用dna产物纯化试剂盒纯化后取2 μl纯化产物进行琼脂糖凝胶电泳，检查产物纯化效果，浓度不低于5ng/μl时，进行下一步操作；

9、步骤4：将步骤2得到的纯化的slwrky6目的片段与步骤3得到的酶切的pbi121-flag质粒连接；

10、步骤5：取步骤4得到的连接产物通过化学热激法转化大肠杆菌dh5α，提取获得pbi121-flag-slwrky6质粒，测序检测；

11、步骤6：将pbi121-flag-slwrky6质粒转化eha105农杆菌；

12、步骤7：将含有pbi121-flag-slwrky6质粒的eha105农杆菌侵染番茄子叶并获得转基因阳性苗slwrky6。

13、优选的技术方案为：步骤3中，酶切反应液为：5 μl 10×cutsmart buffer，20 ngpbi121-flag质粒，2 μl xbai，2 μl xhoi，ddh2o补足至50 μl；pcr扩增参数为：37℃，30min。

14、优选的技术方案为：步骤4中，反应体系为：步骤2的纯化产物0.5 µl，步骤3中pbi121-flag质粒3 µl，5×ce buffer 2 µl，ce连接酶1 µl，ddh2o 3.5 µl，37 ℃ 30min。

15、优选的技术方案为：步骤5中，取步骤4得到的1 μl的连接产物加入到100 µl的大肠杆菌dh5α感受态细胞中，冰上静置25-35 min，42℃热激45s，冰浴2-3 min；在离心管中加入700 µl的lb液体培养基，置于37℃，200rpm摇床中振荡培养50-70min；培养得到的菌液5000 rpm离心1 min，弃上清600µl，吸取剩余菌液均匀涂布于含有卡那霉素的lb固体培养基上，37℃倒置培养16h；挑取单克隆菌落，于10 µl无菌水中吹吸混匀，取2 µl菌液进行菌落鉴定，菌落pcr体系为25 μl：2 μl菌液、正向引物-f /反向引物-r各1 μl、2×rapid taqmaster mix 12.5 μl、ddh2o 8.5 μl，混匀后置于pcr仪中；pcr条件为：预变性95℃，3 min；变性95℃，15 s，退火55℃，1 min，延伸72℃，45 s，35个循环；彻底延伸72℃ 5 min；4℃∞；待反应结束后，在琼脂糖凝胶上检测pcr产物条带大小是否符合理论值，将条带大小正确的剩余菌液转移至3 ml含有卡那霉素的lb液体培养基中，37℃、200 rpm摇床中振荡培养16 h，质粒小提试剂盒提取质粒并跑琼脂糖凝胶验证质粒提取是否成功，将提取出的质粒送往生工公司进一步测序鉴定。

16、正向引物-f：5’-gagaacacgggggactctagaatggacaaaggatggggtctta-3’；

17、反向引物-r：5’-cttgtaatcggtaccctcgaggttccctgggaaactactagtgttatt-3’。

18、优选的技术方案为：步骤6中，取100μl的农杆菌感受态细胞eha105，在冰浴中使其融化，加入1 μl步骤5得到的测序正确的pbi121-flag-slwrky6质粒，用手拨打离心管底部，混匀，依次在冰上静置5 min、液氮5 min、37℃水浴5 min、冰浴5 min；加入700 μl无抗生素的lb液体培养基，于28℃振荡培养2-3 h；6000 rpm离心1 min收菌，留取100 μl左右上清，吹打混匀重悬菌体，涂布于lb-kana/rif固体培养基上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。

19、优选的技术方案为：步骤7中，挑取步骤6中构建好的将pbi121-flag-slwrky6质粒转化eha105农杆菌单菌落于3 ml含50 μg/ml kana和20 μg/ml rif的lb液体培养基中，200rpm，28℃培养12-16 h后取300 µl于20 ml含50 μg/ml kana和20 μg/ml rif的lb液体培养基中，200 rpm，28℃震荡培养6-7 h，用分光光度计检测菌液od600至0.5-0.6；5000 rpm室温离心10 min收集菌体，菌体用无菌水稀释至od600=0.1-0.2；将番茄子叶和茎段黑暗预培养2 d后浸泡于稀释好的农杆菌侵染液中，震荡，侵染5 min后倒掉侵染液，用枪头吸掉多余侵染液，将子叶和茎段再经过含不同植物激素的培养基上分别发芽、芽伸长、生根的过程，将生根的外植体转移至营养土中进行后续测序鉴定，进而得到转化的番茄植株。

20、由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：

21、本发明通过从番茄中得到 slwrky6基因完整的编码序列，设计引物，将目的片段连接到载体pbi121-flag上，利用农杆菌侵染法转化植物，获得转基因植株，对转基因植株进行了分析，结果表明该基因过表达后能够加速番茄果实成熟，同时，该基因可以作为早熟番茄种质资源筛选的分子标记。