一种肌胃糜烂素的半抗原、人工抗原及其应用

本发明涉及免疫检测，更具体地，涉及一种肌胃糜烂素的半抗原、人工抗原及其应用。

背景技术：

1、肌胃糜烂素是发现于鱼粉中的一种生物胺，组胺的衍生物，一种强效的组胺h2受体，主要由鱼粉中高水平的组胺和赖氨酸的ε-nh2在加热干燥处理过程中生成的，其形成主要与鱼粉加工时的温度有关。肌胃糜烂素会对家禽生产造成重大损失，它是家禽发生黑色呕吐病的主要原因，黑呕吐是一种肌胃严重溃疡的疾病，该病是由于肌胃糜烂素和组胺强烈刺激组胺h2受体，导致腺胃盐酸分泌过量所致。毒理学实验表明饲料中肌胃糜烂素水平为1mg/kg时出现生长抑制，水平为2mg/kg时出现死亡，建议家禽日粮中的肌胃糜烂素水平不应超过0.4mg/kg。而含有肌胃糜烂素的饲料中通常含有高浓度的组胺，随着现代畜牧业集约化、产业化的发展，饲料在畜牧业中起着至关重要的作用，饲料安全是食品安全的重要基石已成为不争的事实。

2、由于肌胃糜烂素原药难以获得且缺乏一种简单、快速和敏感的体外特异性地检测鱼粉中肌胃糜烂素的方法，关于肌胃糜烂素对肌胃健康和家禽生产的影响的现有知识仍然很少。因为肌胃糜烂素缺乏限量标准，最早的研究是用鸡的生物测定法来检测肌胃糜烂素，随后建立了高效液相色谱法、lc-ms/ms、纸电泳和m ce-lif等方法检测鱼粉中的肌胃糜烂素，但是仪器分析法需要昂贵的仪器、专业的人员操作与维护、复杂前处理且无法实现现场快速检测。而基于抗原与抗体反应的免疫分析法更适宜开发适合现场快速筛查的检测试剂盒。

3、目前基于抗原抗体反应的免疫分析法主要有：rosselot等制备了3种肌胃糜烂素多克隆抗体，建立的基于3种抗体的同源放射免疫分析法检测限分别为0.048、0.78和0.39ng/mg，特异性检测发现这三种抗体均不与赖氨酸和组氨酸发生交叉反应，但与组胺分别有21％、26％和100％的交叉反应(pmid:8966176)。bec ker等制备的肌胃糜烂素单克隆抗体3h4具有较高的灵敏度和特异性，在0.1～10μg/ml的单克隆抗体与组胺、组氨酸或赖氨酸均未发生交叉反应，但需要耗时的操作如抗体与药物需在4℃的试管溶液中孵育过夜(pmid:9790072)。manosalv a通过竞争性ria分析制备了抗gz 3h4的34种抗独特型抗体，并通过竞争性e lisa筛选出了灵敏度和特异性在0.1～10μg/ml范围内的抗独特型mab 3a12，建立了基于抗独特型mab-hrp的肌胃糜烂素竞争elisa(pmid:15000848)。对于现有的免疫分析技术来说，还未能实现肌胃糜烂素的高灵敏度检测和现场检测应用。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种肌胃糜烂素的半抗原、人工抗原及其应用。

2、本发明的第一个目的是提供一种半抗原的组合物在制备检测检测肌胃糜烂素的人工抗原组合物中的应用。

3、本发明的第二个目的是提供一种人工抗原组合物。

4、本发明的第三个目的是提供任一所述组合物在制备检测肌胃糜烂素试剂盒中的应用。

5、本发明的第四个目的是提供任一所述组合物在非诊断目的检测肌胃糜烂素中的应用。

6、本发明的第五个目的是提供一种基于免疫学的检测肌胃糜烂素的方法。

7、本发明的第六个目的是提供一种基于免疫学的检测肌胃糜烂素的试剂盒。

8、为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

9、本发明尝试以肌胃糜烂素偶联载体蛋白作为免疫原和包被原制备单克隆抗体以建立检测肌胃糜烂素的方法，但是发现制备得到的单克隆抗体的抑制率太低，根本不能满足建立检测方法的需要。经过发明人创造性的劳动，建立了本发明的检测方法。

10、本发明要求保护一种半抗原的组合物在制备检测肌胃糜烂素的人工抗原组合物中的应用，所述半抗原的组合物含有结构式如(i)所示半抗原和结构式如(ii)所示半抗原：

11、

12、

13、优选地，所述人工抗原组合物含有偶联有载体蛋白的结构式如(i)所示半抗原和偶联有载体蛋白的结构式如(ii)所示半抗原。

14、本发明还要求保护一种人工抗原组合物，所述人工抗原组合物含有偶联有载体蛋白的结构式如(i)所示半抗原和偶联有载体蛋白的结构式如(ii)所示半抗原。

15、优选地，所述人工抗原组合物中，偶联有载体蛋白的结构式如(i)所示半抗原为免疫原，偶联有载体蛋白的结构式如(ii)所示半抗原为包被原。

16、即，免疫原的结构式如式(vii)所示，包被原结构式如式(viii)所示，

17、

18、更优选地，所述免疫原偶联的载体蛋白为牛血清白蛋白，即为偶联有牛血清白蛋白(bsa)的结构式如(i)所示半抗原，其结构式如式(vii-1)所示，

19、

20、更优选地，所述包被原偶联的载体蛋白为鸡卵清白蛋白，即为偶联有鸡卵清白蛋白(ova)的结构式如(ii)所示半抗原，其结构式如式(viii-1)所示，

21、

22、任一所述组合物在制备检测肌胃糜烂素试剂盒中的应用，也属于本发明的保护范围。

23、任一所述组合物在非诊断目的检测肌胃糜烂素中的应用，也属于本发明的保护范围。

24、本发明进一步要求保护一种基于免疫学的检测肌胃糜烂素的方法，利用任一所述人工抗原组合物、或任一所述人工抗原组合物中的包被原和抗体，所述抗体是利用任一所述人工抗原组合物中的免疫原制备得到。

25、作为一个具体的实施例，所述方法包括以下步骤：

26、包被：将所述包被原加入酶标版，充分孵育后洗涤、封闭；

27、与抗体反应：将梯度稀释好的肌胃糜烂素或待测样本分别加入包被好的酶标板孔中，以所述免疫原制备得到的单克隆抗体，充分反应后，洗板，清除残留液体；

28、与二抗反应；标板孔中二抗，充分反应后，洗板，清除残留液体；

29、显色：使用显色液显色之后，加入终止液；

30、检测：波长450nm条件下检测各孔的吸光值；

31、本发明进一步要求保护一种基于免疫学的检测肌胃糜烂素的试剂盒，

32、所述试剂盒是利用任一所述组合物制备得到，或者含有以下组分的至少一种：

33、任一所述人工抗原组合物、

34、或者含有任一所述人工抗原组合物中的包被原和抗体，所述抗体是利用任一所述人工抗原组合物中的免疫原制备得到。

35、更优选地，还含有ph9.6碳酸缓冲液、封闭液、ph＝7.4的pbs磷酸盐缓冲液；肌胃糜烂素标准品、二抗、显色液、和终止液中的一种或几种

36、作为一个具体的实施例，所述试剂盒使用方法包括以下步骤：

37、包被：将所述包被原加入酶标版，充分孵育后洗涤、封闭；

38、与抗体反应：将梯度稀释好的肌胃糜烂素或待测样本分别加入包被好的酶标板孔中，以所述免疫原制备得到的单克隆抗体，充分反应后，洗板，清除残留液体；

39、与二抗反应；标板孔中二抗，充分反应后，洗板，清除残留液体；

40、显色：使用显色液显色之后，加入终止液；

41、检测：波长450nm条件下检测各孔的吸光值；

42、更优选地，还含有ph9.6碳酸缓冲液、封闭液、ph＝7.4的0.01mol/l pbs磷酸盐缓冲液；肌胃糜烂素标准品、组胺标准品、二抗、显色液、和终止液中的一种或几种。

43、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

44、本发明基于肌胃糜烂素的结构首次合成了不同于原药的免疫原，并以此为基础制备了检测肌胃糜烂素的抗体，建立了免疫分析法。与现有报道的免疫检测方法相比，本检测方法在高灵敏度和低交叉反应率方面都极具优势，能够满足家禽日粮中的肌胃糜烂素最大推荐浓度0.4mg/kg的检测需求，为肌胃糜烂素的现场检测需求提供理论依据。本检测方法检测肌胃糜烂素的线性检测范围为1.25～12.03ng/ml，ic50值为3.88ng/ml，检出限(ic10)为0.65ng/ml。