漆酶突变体及其应用的制作方法

：本发明属于生物工程，具体涉及漆酶突变体及编码基因和应用。

背景技术

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背景技术：

1、漆酶是一种含四个铜离子的多酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶，以单体糖蛋白的形式存在。

2、目前已有大量的细菌漆酶基因被克隆出来，如大肠杆菌的cueo、枯草芽孢杆菌的cota、谷氨酸棒状杆菌的cgl1、丁香假单胞菌的copa等。同来源于真核生物的漆酶相比，细菌漆酶具有基因克隆方便、热稳定性好、酶活ph值广泛、无糖基化修饰等优点。

3、漆酶因品种不同最适ph值不同、适宜温度不同，也因底物不同而异，但都在酸性ph范围内，不适用于碱性ph范围内使用。漆酶活性部分的氨基酸含有酸性基团和碱性基团，在不同ph值时因解离状态不同，ph对酶活性影响主要有三种情况:酸或碱使酶的空间结构改变，引起酶的活性丧失；酸或碱影响酶的活性部分的解离状态，使得底物不能被分解；酸或碱破坏了底物的解离状态，使底物与酶无法结合。

4、国内对漆酶的应用研究，主要集中在纸浆漂白、染料废水脱色、提升食品品质、降解饲料中的黄曲霉毒素等方面。其工业应用，一般都是在高温及酸碱变换的环境，例如在造纸工业中的煮炼和漂白的环节中，高温和碱性环境的要求；在果汁等饮料的生产中，酸性环境下降解其中的酚类物质，使饮料澄清，以保证饮品品质的稳定；在食品高温烘焙时加入漆酶，可使食品风味好，更筋道；在饲料深加工中，不同ph及高温蒸煮环节中，加入漆酶，以去除黄曲霉毒素。

5、酶在酸碱及高温环境下的稳定性差，导致酶解效果并不理想，发酵酶活水平低，导致应用成本较高，难以在工业上推广应用。因此，现阶段漆酶的工业化应用亟待解决的问题，包括但不限于以下几点：1.耐高温；2.耐酸碱；3.发酵酶活水平高。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、本发明的主要目的是提供一种漆酶突变体及其基因、及含有该基因的重组表达载体和重组菌株、及该重组菌制备漆酶的方法，旨在解决现有技术中漆酶耐酸碱耐热性差、发酵酶活水平低的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供的技术方案之一，是一种漆酶突变体，所述突变体是将seq id no.1所示野生型漆酶氨基酸序列中第141、198、341、389和476位点的w、t、r、i、s，分别突变为c、p、s、t、r获得的，所述突变体的氨基酸序列如序列表seq id no.2所示。

3、本发明还提供上述突变体的编码基因；

4、进一步地，所述编码基因的核苷酸序列如序列表seq id no.4所示。

5、本发明提供的技术方案之二，是上述漆酶突变体的应用，特别是在降解真菌毒素中的应用，特别是对黄曲霉毒素的降解；更特别的是在饲料工业中降解黄曲霉毒素的应用。

6、本发明提供的技术方案之三，是包含上述漆酶突变编码基因的重组载体或重组菌株；

7、优选地，所述重组载体所采用的表达质粒为ppiczαa；

8、优选的，所述重组菌株采用的的宿主细胞为毕赤酵母x33。

9、本发明提供的技术方案之四，是上述重组表达载体或重组菌株的应用，特别是在制备技术方案一所述漆酶突变体中的应用；

10、进一步地，采用上述重组菌株制备漆酶突变体的方法如下：

11、发酵罐中的培养：按照发酵罐培养基体积的4-6％进行接种，培养温度28-30℃，罐压0.04-0.08mpa，初始转速100rpm，初始风量200m3/h，最高转速600rpm，最高通风量4000m3/h；

12、补料的控制：当发酵至菌体湿重达到60-70g/l时，开始流加30-40％的甘油，流加速度为600-700kg/h，当菌体湿重达到150-160g/l时，停止流加甘油，饥饿处理1-1.5h，然后开始流加甲醇，前1-2h，流加甲醇的流速为100-150kg/h，1-2h后，甲醇的流加速度每小时增加30-50kg，直至达到最大补料速率为300-350kg/h，保持该补料速度直至发酵结束；

13、溶氧的控制：开始流加甲醇前，通过调节转速和风量控制溶氧达到30-40％，开始流加甲醇后，控制溶氧20％-30％，达到最高转速和通风量后，溶氧不再控制；

14、补氨控制ph在4.5-5.5；

15、菌体自溶严重时结束发酵，培养周期180-200h。

16、进一步地，种子罐中培养条件为：5-7％接种量，温度28-30℃，罐压0.04-0.08mpa，初始转速100rpm，初始风量20m3/h，通过加转速和风量控制溶氧大于30％，最高转速600rpm，最高通风量200m3/h，补氨控制ph在4.5-5.5，培养48-50h；

17、进一步地，种子培养基组成为(w/v)：甘油2-3％，磷酸一铵4-6％，磷酸氢二钠0.2-0.5％，硫酸镁2-2.5％，硫酸钾1-1.3％，硫酸钙0.1-0.3％，氢氧化钾0.1-0.2％，磷酸0.02-0.08％，其余为水，ph在4.5-5.5；

18、进一步地，发酵培养基组成为(w/v)：甘油5-6％，磷酸一铵6-7％，磷酸氢二钠0.3-0.5％，硫酸镁2.5-3.5％，硫酸钾1-1.6％，硫酸钙0.1-0.4％，氢氧化钾0.1-0.2％，磷酸0.03-0.1％，其余为水，ph在4.5-5.5。

19、有益效果：

20、本发明提供的漆酶突变体，最适反应ph为4.5，在ph3.0-9.0的条件下处理24h后，相对酶活力仍然保持在90％以上，最适反应温度为85℃，在40-80℃条件下保温15h，仍能保留95％以上的酶活。

21、本发明提供的漆酶突变体，通过表达质粒ppiczαa在毕赤酵母x33中进行表达，在60m3发酵罐中的平均发酵酶活力为106673u/l，能进一步降低漆酶的生产成本，促进漆酶在降解真菌毒素方面的广泛应用。

22、此外，本发明确认了漆酶中与耐酸碱、耐热性能相关的5个氨基酸位点，并证明了这些位点对于该酶耐酸碱、耐热性能的重要性，对于研究漆酶的耐酸碱、耐热性能提供了重要的线索，同时对于其它漆酶的研究提供了可靠的参考依据。

技术特征：

1.一种漆酶突变体，其特征在于，所述漆酶突变体氨基酸序列如seq id no.2所示。

2.权利要求1所述漆酶突变体的编码基因。

3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如seq idno.4所示。

4.包含权利要求2所述编码基因的重组载体或重组菌株。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，采用的表达质粒为ppiczαa。

6.如权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，采用的宿主菌为毕赤酵母x33。

7.权利要求4所述重组载体或重组菌株在生产权利要求1所述漆酶突变体中的应用。

8.权利要求1所述漆酶突变体的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，是在降解真菌毒素中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，是在降解黄曲霉毒素中的应用。

技术总结
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及漆酶突变体及编码基因和应用。所述漆酶突变体是通过原始漆酶进行W141C、T198P、R341S、I389T、S476R突变获得的，具有序列表SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。突变后的漆酶最适反应pH为4.5，在pH3.0‑9.0的条件下处理24h后，相对酶活力仍然保持在90％以上，最适反应温度为85℃，在40‑80℃条件下保温15h，仍能保留95％以上的酶活。本发明提供的漆酶突变体，通过表达质粒pPICZαA在毕赤酵母X33中进行表达，在60m<supgt;3</supgt;发酵罐中的平均发酵酶活力为106673U/L，能进一步降低漆酶的生产成本，促进漆酶在降解真菌毒素方面的广泛应用。

技术研发人员：张辉,佟新伟,张法玲,王兴吉,郭庆文,曹世源
受保护的技术使用者：山东隆科特酶制剂有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/25