一种红鲫的性状改良方法及其应用

本发明属于鱼类性状改良领域，尤其涉及一种红鲫(carassius auratus redvar.)的性状改良方法。

背景技术：

1、红鲫(carassius auratus red var.)鲫的变种，隶属于鲤科，鲤亚科，鲫属，因体色鲜艳、适应性强和繁殖力强，具有产卵量大，受精率和存活率高等优点，因此在水产养殖和育种领域中得到了很好的应用与研究。红鲫体表通红，且具有体色变迁的变色机制(青灰色-变色期-橙黄色-红色)，具备较强的观赏价值。此外，红鲫作为鱼类种质改良的重要资源，已被运用于创制优良鱼类品系，利用远缘杂交创制了生长速度快、肉质鲜嫩、抗逆性强的合方鲫品系(日本白鲫和雄性红鲫杂交)，新型异源四倍体鲫鲤品系(雌性红鲫和雄性鲤鱼杂交)和重要的同源四倍体鲫品系(雌性红鲫和雄性团头鲂杂交)。因此，红鲫可作为一种集观赏和种质资源于一体的重要的模式鱼类。

2、如何更好的利用和改进现有的生物技术和方法，以红鲫为主体对其进行可控选育以获得预期的重要性状，使其得到更广泛的应用，就成为一个重要的问题。

3、目前crispr/cas9基因编辑技术在鱼类中得到了广泛运用，是鱼类可控性状改良和进化的重要手段。因此，基因编辑技术在红鲫中的应用不仅可丰富体色，提高市场观赏价值，而且可以其特有的改良性状为基础创制新型鱼类，丰富鱼类种质资源。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种红鲫的性状改良方法。

2、为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

3、一种红鲫的性状改良方法，包括如下步骤：

4、(1)根据获得的红鲫cds或dna序列，完成其同源基因和等位基因靶点的设计，得到靶点序列链和通用引物链；以待用亲本红鲫dna为模板，完成特异靶点区域的pcr扩增和测序，sanger测序结果显示合格亲本靶点处序列必须无任何突变，峰图显示为单峰，筛选的合格亲鱼分开饲养备用；

5、(2)将步骤(1)得到的靶点序列链和通用引物链为引物pcr扩增合成双链，随后进行pcr产物回收，以pcr回收产物为模板进行体外转录，采用75％冷乙醇法对转录产物进行纯化；同时，以pcr回收产物为模板配置靶点体外活性体系，筛选切割效率超过50％的grna为体外活性验证合格的sgrnas；

6、(3)采用人工干法授精法，在体式显微镜下观察红鲫受精卵，将所述体外活性验证合格的sgrnas和cas9混匀注射至优质受精卵的一细胞期动物极，采取一次注射法；随着发育时间的增加，受精卵的粘附性逐渐减弱，难以较好的固定，影响注射效率，此外，卵膜逐渐变硬，既难以注射也易导致受精卵破裂，影响受精卵的存活，因此要在短时间内完成一次注射；

7、(4)为减少受精卵膜粘连水中碎屑和有助于鱼苗破膜而出，提高存活率和孵化率，将所有注射胚胎进行流水培育，期间挑出死卵和发霉的卵，直到鱼苗开始水平游泳后转移到户外饲养。

8、上述的红鲫的性状改良方法，优选的，在步骤(1)中，所述同源基因(如果有)和等位基因靶点(如果有)之间应存在1个或多个碱基差异。

9、优选的，在步骤(2)中，所述以pcr回收产物为模板配置靶点体外活性体系的具体操作方法如下：将cas9蛋白、pcr产物、grna混合并37℃孵育30min，以未处理的pcr产物作为对照进行2％的琼脂糖凝胶电泳检测，检测grna是否将pcr产物切割为较短片段，并通过分析处理的pcr产物与对照pcr产物的亮度，估算grna的切割效率。

10、更优选的，所述cas9蛋白的浓度为20pmol/μl，所述pcr产物的浓度为25ng/μl，所述grna的浓度为50ng/μl，三者的混合比例为1:1:2。

11、优选的，在步骤(2)中，所述pcr产物均经过1％琼脂糖凝胶检测确认为单一条带，大小在100bp稍上位置；所述pcr产物回收按照neb monarch pcr&dna cleanup kit试剂盒说明书进行，所述体外转录使用neb hiscribe t7高效rna合成试剂盒进行。

12、优选的，在步骤(3)中，采用人工干法授精法，将红鲫精液和卵子混匀后均匀撒入20cm水底处放置玻璃皿的水桶中完成受精，待受精卵完全粘于玻璃皿；所述优质受精卵表现为：形状圆润饱满，卵内容物晶莹清澈。

13、优选的，在步骤(3)中，所述sgrnas的浓度为150ng/μl-200ng/μl，所述cas9的浓度为20pmol/μl，二者混合体积比为3∶1，在16-18℃的环境中进行注射，注射量占卵面积的八分之一，在五分钟之内完成一次注射。

14、红鲫是一种集观赏和种质资源于一体的优质鱼类，关于如何利用红鲫更好的丰富市场观赏鱼品种以及利用其作为一种重要的种质资源来创制优良鱼类问题，本发明利用基因敲除技术对其进行编辑以获得重要的优良性状。在编辑操作过程中，经过反复试验，sgrnas(150ng/μl-200ng/μl)和cas9(20pmol/μl)的比例注射量为3:1，且注射量约占卵面积的八分之一，此时效果最佳；此外，随着发育时间的增加，受精卵的粘附性逐渐减弱，难以较好的固定，影响注射效率，卵膜逐渐变硬，既难以注射也易导致受精卵破裂，影响受精卵的存活，因此我们在五分钟之内完成一次注射；为减少受精卵膜粘连水中碎屑和有助于鱼苗破膜而出，提高存活率和孵化率，注射卵置于流水中培育。

15、基于一个总的发明构思，本发明还提供一种红鲫的体色改良方法，采用上述的性状改良方法，对红鲫的体色控制基因scarb1基因或tyr基因进行敲除。

16、上述的红鲫的体色改良方法，优选的，所述scarb1基因包括同源基因：scarb1a、scarb1b；

17、所述scarb1a的等位基因scarb1a-a和scarb1a-b的核苷酸序列genbank登录号分别为op466726和op466727；

18、所述scarb1b的等位基因scarb1b-a和scarb1b-b的核苷酸序列genbank登录号分别为op466728和op466729；

19、所述tyr基因包括同源基因：tyra和tyrb，其核苷酸序列genbank登录号分别为op466737和op466738。

20、优选的，敲除所述scarb1基因时采用的scarb1a-a和scarb1a-b基因编码区扩增引物为：

21、f：atggcggtgtctaagtctacagtag(如seq id no：3所示)，

22、r：ttagctttctggggtccgtagt(如seq id no：4所示)；

23、scarb1b-a和scarb1b-b基因编码区扩增引物为：

24、f：atggcggtgtctaaatctacattatca(如seq id no：5所示)，

25、r：tattgcataaacgacagcaggtaa(如seq id no：6所示)；

26、敲除所述tyra基因时采用的tyra基因编码区扩增引物为：

27、f：atgcgtccggctctcatc(如seq id no：17所示)，

28、r：tcacagtgtagtctgatatgaagtgg(如seq id no：18所示)；

29、tyrb基因编码区扩增引物为：

30、f：atgtctctctctctgcttctgttc(如seq id no：19所示)，

31、r：cgacttcatatcagactacactgtga(如seq id no：20所示)。

32、基于一个总的发明构思，本发明还提供一种红鲫的雌性性腺发育性状改良方法，采用上述的性状改良方法，对红鲫的雌性性腺发育控制基因foxl3基因进行敲除。

33、所述foxl3基因包括同源基因：foxl3-1和foxl3-2，其核苷酸序列分别如seq idno：1、seq id no：2所示。

34、优选的，敲除所述foxl3基因时采用的foxl3-1基因编码区扩增引物为：

35、foxl3-1-f：5’-atgatgtttgacagctcgcaatatc-3’(如seq id no：25所示)；

36、foxl3-1-r：5’-ctatggttttggttagatggtccaga-3’(如seq id no：26所示)；

37、foxl3-2基因编码区扩增引物为：

38、foxl3-2-f：5’-atgatgtttgacagctcgcaatatc-3’(如seq id no：27所示)；

39、foxl3-2-r：5’-ttacatggtccagaagtgtagattga-3’(如seq id no：28所示)。

40、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

41、1、本发明选用的红鲫体色鲜红且具备体色变迁，且属于鱼类种质改良的重要资源，已被运用于创制优良鱼类品系，是一种集观赏和种质资源于一体的优质鱼类。

42、2、在编辑操作过程中，经过反复试验，sgrnas(150ng/μl-200ng/μl)和cas9(20pmol/μl)的体积比注射量为3:1，且注射量约占卵面积的八分之一，此时效果最佳；此外，随着发育时间的增加，受精卵的粘附性逐渐减弱，难以较好的固定，影响注射效率，卵膜逐渐变硬，既难以注射也易导致受精卵破裂，影响受精卵的存活，因此我们在五分钟之内完成一次注射；为减少受精卵膜粘连水中碎屑和有助于鱼苗破膜而出，提高存活率和孵化率，注射卵置于流水中培育。

43、3、本发明利用基因敲除获得不同的体色变异红鲫以及雌性性腺发育良好的红鲫，证明crispr/cas9基因编辑技术可高效的作用于红鲫，证实确实可产生特定体色和雌性性腺发育良好的红鲫。