本发明属于酶工程，具体涉及一种高热稳定性的酮泛解酸羟甲基转移酶突变体及应用。
背景技术：
：：1、蛋白质的热稳定性是指其在高温状态下维持自身的稳定性和功能性的能力，对蛋白质热稳定性的研究不仅可以加深我们对蛋白质的结构和功能的了解，而且可以加深我们对蛋白质的折叠、去折叠和错误折叠的动态过程的认识。2、在结构组成上，蛋白存在单聚体和多聚体两种形式，其中多聚体蛋白由2个及以上的同源或异源亚基组成。对于多亚基酶来讲，亚基间是通过范德华力、氢键以及静电等非共价作用连接从而保持酶分子整体构象的稳定性，这些作用力较弱，在逆境下容易被破坏，成为酶分子变性的重要原因(computational design of protein self-assembly[j].current opinion in structural biology,2016,39:39-49)。因此，寻找一种新型蛋白质改造方法对于提高多亚基蛋白质的稳定性具有重要意义。3、亚基界面改造工程是基于酶的晶体结构以及亚基界面的作用力分析，在亚基界面处引入稳定性突变，来重构或增强亚基之间的几种关键作用力，从而避免亚基之间的解离，这是当前提高多聚体蛋白亚基相互作用的主要方法之一。bogin等通过同源序列比对，将嗜热来源的乙醇脱氢酶的亚基界面处的盐桥引入到嗜温来源的乙醇脱氢酶中，提高了其热稳定性(structural basis for theenhanced thermal stability of alcoholdehydrogenase mutants from the mesophilic bacterium clostridium beijerinckii:contribution of salt bridging[j].protein science a publication of the proteinsociety,2002,11(11):2561-2572)。j c williams等将磷酸丙糖异构酶(tim)亚基界面处的天冬氨酸替换为天冬酰胺后，与毗邻氨基酸之间形成的氢键网络使该酶的熔解温度提高了26℃(structural and mutagenesis studies of leishmania triosephosphateisomerase:a point mutation can convert a mesophilic enzyme into a superstableenzyme without losing catalytic power[j].protein engineering,1999,12(3):243-256)。4、酮泛解酸羟甲基转移酶(ketopantoate hydroxymethyltransferase,kphmt,ec2.1.2.11)是panb基因的表达产物，催化底物α-酮异戊酸增加一个甲基形成酮泛解酸，反应过程是可逆的。在m.tuberculosis和e.coli中panb的晶体结构数据表明，酶的四级结构为十聚体，由10个相似的亚基组成，5个亚基嵌合在一起形成五聚体，2个五聚体结合成十聚体，属于(βα)8磷酸烯醇式丙酮酸超家族的成员(comparative analysis of theescherichia coli ketopantoate hydroxymethyltransferase crystal structureconfirms that it is a member of the(betaalpha)8phosphoenolpyruvate/pyruvatesuperfamily[j].journal of bacteriology.2003；185(14):4163-71.)。有研究报道称该酶是d-泛酸合成过程的关键酶，一株具有高活性高稳定性的菌株可以有效增加底物a-酮戊异酸的可用性，从而提高d-泛酸的产量。5、近年来，得益于结构生物学及生物信息学的发展，基于蛋白质结构和序列信息来提高蛋白质热稳定性的计算方法得到了广泛应用。δδg是反应突变对蛋白质热稳定性影响的关键指标，如果能准确的计算出该值即可准确的确定突变位点。温度因子(b-factor)通常用于表示蛋白质的灵活度，b-factor是从x射线数据获得的原子位移参数，主要是用来体现晶体中原子构象状态的一种模糊度，b-factor越高，模糊度越大，相应部位的构象就越不稳定。然而，单独的某一种计算策略可能有一定的局限性。基于对酶结构和功能的深刻认识，结合多种计算方法，将目标集中在少量的位点上，筛选出具有高稳定性的酮泛解酸羟甲基转移酶菌株，其优势在于既可以减少单一算法中的采样偏差，降低假阳性的概率，又大大缩小了突变体文库，更容易获得正向突变结果。技术实现思路1、本发明的目的是在于提供一种高热稳定性的酮泛解酸羟甲基转移酶突变体及在催化a-酮异戊酸生成酮泛解酸中的应用，本发明通过在多聚体蛋白的亚基接触界面间引入突变体，来重构或者增强亚基作用力，使多聚体蛋白的各个亚基间连接更加紧密，极大的增强其稳定性，本发明方法获得的热稳定性提高的酮泛解酸羟甲基转移酶突变体能够用于d-泛酸的合成生产，解决底物对酮泛解酸羟甲基转移酶的反馈抑制问题，从而提高底物利用率，降低生产成本。2、本发明采用的技术方案：3、本发明提供一种高热稳定性的酮泛解酸羟甲基转移酶突变体，所述酮泛解酸羟甲基转移酶突变体是将seq id no.3所示氨基酸序列第98位、第106位或第247位进行单突变或多突变获得的。4、优选的，所述酮泛解酸羟甲基转移酶突变体是seq id no.3所示氨基酸序列分别突变为下列之一：(1)第98位谷氨酸突变为苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；(2)第106位谷氨酸突变为丝氨酸、亮氨酸；(3)第247位丝氨酸突变为异亮氨酸或天冬氨酸。5、本发明所述酮泛解酸羟甲基转移酶突变体按如下方法筛选：6、(1)依据pymol软件确定酮泛解酸羟甲基转移酶蛋白的亚基a-b、a-i界面间的位点；7、(2)通过deepddg(http://protein.org.cn/ddg.html)评估界面点突变对酮泛解酸羟甲基转移酶解析折叠自由能的影响，δδg大于0的是正向突变(δδg＝δgwild-type-δgmutation)，选择δδg≥0.5kcal/mol的氨基酸作为突变位点；8、(3)b-fitter软件(http://www.kofo.mpg.de/en/research/biocatalysis)识别界面氨基酸位点的b-factor值；b-factor越高，模糊度越大，相应部位的构象就越不稳定；9、(4)在consurf服务器(https://consurf.tau.ac.il/)上进行多个序列比对分析蛋白质的保守性，并且使用pymol生成图像，根据氨基酸残基进化保守性，筛选突变位点。10、本发明还提供一种所述酮泛解酸羟甲基转移酶突变体在催化α-酮异戊酸制备酮泛解酸中的应用，所述应用是指：以含酮泛解酸羟甲基转移酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎提取的纯酶液为催化剂，以α-酮异戊酸为底物，加入硫酸镁、甲醛、四氢叶酸，以ph8-10.0的缓冲液为反应介质构成转化体系，在30-40℃、500-1000rpm(优选37℃、800rpm)下进行转化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得酮泛解酸。11、优选的，所述转化体系中，湿菌体加入终浓度为50-150g/l，优选100g/l；纯酶液以蛋白含量计为0.01-0.1mg/ml，优选0.05mg/ml；底物加入终浓度为5-20mm，优选10mm；硫酸镁加入终浓度为1-10mm，优选5mm；甲醛加入终浓度为1-10mm，优选5mm；四氢叶酸终浓度为0.01-0.1mm，优选0.05mm。12、优选的，所述反应介质为ph 10.0、100mm的gly-naoh缓冲液。13、优选的，所述应用按如下步骤进行：先将甲醛、四氢叶酸加入ph10.0的gly-naoh缓冲液中，在30-40℃(优选37℃)孵育5min来制备n5,n10-亚甲基四氢叶酸，再加入硫酸镁、底物和催化剂进行转化反应。14、优选的，所述催化剂按如下方法制备：15、(1)将含酮泛解酸羟甲基转移酶突变体编码基因的工程菌接种于含有终浓度50μg/ml kan的lb培养基中，37℃，180rpm恒温摇床培养8-12h，作为种子液；16、(2)将种子液按照体积浓度1％的接种量加入含终浓度50μg/ml的kan抗性的新鲜灭菌lb液体培养基，37℃，180rpm培养至od600nm达到0.6-1.0；17、(3)加入终浓度为0.1mm的iptg(异丙基硫代半乳糖苷)进行诱导，于28℃，180rpm恒温振荡摇床中过夜培养；菌液8000rpm离心10min，收集湿菌体；18、(4)将湿菌体重悬于20mm ph 8.0磷酸盐缓冲液中，置于冰上超声破碎30min(250w，破1s，停1s)后，将细胞破碎液于4℃，10000rpm低温离心10min，获得粗酶液；将粗酶液于0.45μm过滤除杂后，收集上清液；19、(5)ni2+柱用平衡缓冲液以3ml/min的流速将uv线和电导线冲至平衡，以0.5ml/min流速上样上清液；上样结束后，采用平衡缓冲液以3ml/min流速冲平uv线，冲平后用85％的平衡缓冲液混合15％的buffer b洗脱杂蛋白，洗脱速度3ml/min，直至基线平衡；采用100％buffer b洗脱目的蛋白，洗脱速度为1ml/min，洗脱量为6个柱体积，收集目的蛋白洗脱液，装入透析袋(截留分子量为10kd)中，采用20mm ph 8.0pb缓冲液过夜透析除盐，截流液即为纯酶液。平衡缓冲液组成：50mm磷酸盐缓冲液，0.3m nacl；buffer b组成：50mm磷酸盐缓冲液，0.3m naci，500mm咪唑。20、与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明以酮泛解酸羟甲基转移酶kphmt为研究对象，在计算机辅助设计的基础上通过对该多聚体蛋白的亚基界面进行分析。在该酶的a-b界面和a-i界面之间引入突变，通过增加界面亚基间的相互作用提高了酮泛解酸羟甲基转移酶的稳定性。该方法避免了蛋白质改造中位点筛选工作量大、耗时久等问题，同时为其他多聚体蛋白稳定性的提高提供了新的思路。与模板菌株k25a/e189s相比，通过本发明得到的突变体k25a/e189s/e106s、k25a/e189s/e106l、k25a/e189s/e98q、k25a/e189s/e98t、k25a/e189s/e98n、k25a/e189s/s247i、k25a/e189s/s247d的tm值分别提高了8.9、1.9、4.4、1.5、6.4、4.2和2.2℃，k25a/e189s/e106s、k25a/e189s/e98t、k25a/e189s/e98n、k25a/e189s/s247i、k25a/e189s/s247d的半衰期分别延长了3min、18min、3min、82min和24min。高稳定性突变体可以有效促进底物a-酮异戊酸生成酮泛解酸，催化效率大大提高，同时降低了底物对酶的反馈抑制作用，具有较好的应用价值。当前第1页12当前第1页12