一种人结肠癌类器官培养方法及其应用

本发明属于生物，具体公开了一种人结肠癌类器官培养方法及其应用。

背景技术：

1、肿瘤微环境对肿瘤的发生发展具有重要的影响，各种动物模型的构建使肿瘤微环境的研究得到飞跃发展，然而动物实验成本高、周期长，仅限于允许的饲养环境，且动物与人类仍然存在种属差异，转基因鼠也仅局限于某些蛋白人源化，经常不能够预测药物在人体中的疗效。人体类器官与真正的器官非常相似，为此，本发明采用人体结肠癌组织构建了一种模拟人体3d肿瘤微环境的人结肠癌类器官，提供了一种周期短、效率高、成本相对较低，且更接近人体的药物筛选和评价方法。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的在于提供一种高效、稳定的人结肠癌类器官培养方法，其包括以下步骤：

2、将人结肠癌组织消化成单细胞悬液，裂红后与预冷的基质胶混匀铺板，倒置放入培养箱，待基质胶凝固后加入类器官培养基进行培养，获得人结直肠癌类器官；所述的类器官培养基组成为：advanced dmem f12培养基、20％r-spondin 1-conditioned medium、10％noggin、10mm nicotinamide、1mm n-acetyl cysteine、1×b-27supplement、50ng/mlrecombinant human egf、500nm a83-01、10μm sb202190、10μm y-27632、10nmprostaglandin e2；所述的advanced dmem f12培养基包含2mm ultraglutamine i、10mmhepes。

3、进一步的，所述的人结肠癌类器官培养方法，包括以下步骤：

4、(1)将人结肠癌组织用含1％双抗的pbs缓冲液洗净，移除多余的脂肪及坏死组织后剪碎，用消化液消化，加入pbs缓冲液终止消化后离心；用pbs缓冲液重悬细胞后，用细胞筛网过滤细胞悬浮液，pbs缓冲液清洗筛网，洗出液离心后，用pbs缓冲液清洗沉淀；往沉淀加入红细胞裂解液进行裂解后，加入pbs缓冲液中和反应并离心，用预冷的类器官培养基重悬细胞，得到细胞悬液；

5、(2)将细胞悬液与与预冷的基质胶混匀铺板，倒置放入培养箱，待基质胶凝固后加入类器官培养基进行培养，获得人结直肠癌类器官。

6、所述的细胞筛网的孔径为40μm。

7、所述消化的条件是37℃作用15min，3-4min震荡一下；所述裂解的条件是室温下反应1min。

8、所述细胞悬液的细胞量为＞3.9×105个/ml。

9、本发明的另一个目的在于提供一种人结肠癌类器官与自体外周血单个核细胞(pbmc)共培养进行药物筛选与评价的方法，包括以下步骤：

10、(1)按照上述的方法培养获得人结肠癌类器官；

11、(2)采用ficoll-paque plus密度梯度离心方法，新鲜分离获得自体外周血单个核细胞；

12、(3)将外周血单个核细胞与人结肠癌类器官混合，加入待测药物，共同培养；采用流式细胞分析方法检测pbmc中免疫细胞亚群的变化，采用hoechst、caspase 3荧光共定位评价待测药物的抗肿瘤免疫活性。

13、步骤(3)中，所述外周血单个核细胞的用量为2×105个/孔；所述人结肠癌类器官的用量为50-100个/孔。

14、所述共同培养的条件是37℃，5％co2条件下共培养12～48h。

15、所述共同培养的培养液为：advanced dmem f12培养基、20％r-spondin 1-conditioned medium、10％noggin、10mm nicotinamide、1mm n-acetyl cysteine、1×b-27supplement、50ng/ml recombinant human egf、500nm a83-01、10μm sb202190、10μm y-27632、10nm prostaglandin e2；所述的advanced dmem f12培养基包含2mmultraglutamine i、10mm hepes。

16、本发明提供了一种人结肠癌类器官培养方法，采用本发明方法培养2天后可以观察到小的类器官形成，培养8-9天后，类器官的直径达到300-500μm，此时可以进行传代，并与自体pbmc共培养进行药物筛选与评价。本发明还提供一种人结肠癌类器官与自体外周血单个核细胞(pbmc)共培养进行药物筛选与评价的方法，该方法将人结肠癌类器官与自体pbmc共培养后采用流式细胞仪，以及hoechst、caspase 3荧光共定位评价的手段来评价药物的抗肿瘤免疫活性。相较于现有技术，本发明建立了一种周期短、效率高、成本相对较低，更接近人体的药物筛选和评价方法。

技术特征：

1.一种人结肠癌类器官培养方法，其特征在于，包括以下步骤：将人结肠癌组织消化成单细胞悬液，裂红后与预冷的基质胶混匀铺板，倒置放入培养箱，待基质胶凝固后加入类器官培养基进行培养，获得人结直肠癌类器官；所述的类器官培养基组成为：advanceddmemf12培养基、20％r-spondin 1-conditioned medium、10％noggin、10mmnicotinamide、1mmn-acetyl cysteine、1×b-27supplement、50ng/ml recombinant humanegf、500nm a83-01、10μm sb202190、10μm y-27632、10nm prostaglandin e2；所述的advanced dmem f12培养基包含2mm ultraglutamine i、10mm hepes。

2.根据权利要求1所述的人结肠癌类器官培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的人结肠癌类器官培养方法，其特征在于，所述的细胞筛网的孔径为40μm。

4.根据权利要求2所述的人结肠癌类器官培养方法，其特征在于，所述消化的条件是37℃作用15min，3-4min震荡一下；所述裂解的条件是室温下反应1min。

5.根据权利要求2所述的人结肠癌类器官培养方法，其特征在于，所述细胞悬液的细胞量为＞3.9×105个/ml。

6.一种人结肠癌类器官与自体外周血单个核细胞共培养进行药物筛选与评价的方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述外周血单个核细胞的用量为2×105个/孔；所述人结肠癌类器官的用量为50-100个/孔。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述共同培养的条件是37℃，5％co2条件下共培养12～48h。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述共同培养的培养液为：advanceddmemf12培养基、20％r-spondin 1-conditioned medium、10％noggin、10mmnicotinamide、1mm n-acetyl cysteine、1×b-27supplement、50ng/ml recombinanthuman egf、500nma83-01、10μm sb202190、10μm y-27632、10nm prostaglandin e2；所述的advanceddmem f12培养基包含2mm ultraglutamine i、10mm hepes。

技术总结
本发明公开了一种人结肠癌类器官培养方法及其应用。该方法包括以下步骤：将人结肠癌组织消化成单细胞悬液，裂红后与预冷的基质胶混匀铺板，倒置放入培养箱，待基质胶凝固后加入类器官培养基进行培养，获得人结直肠癌类器官。采用本发明方法培养2天后可以观察到小的类器官形成，培养8‑9天后，类器官的直径达到300‑500μm。本发明还提供一种人结肠癌类器官与自体PBMC共培养进行药物筛选与评价的方法，该方法具有周期短、效率高、成本相对较低，更接近人体等优点。

技术研发人员：余惠娟
受保护的技术使用者：广东省科学院动物研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15