用于脐带血CD34阳性造血干细胞体外红系分化的培养基的制作方法

本发明涉及用于脐带血cd34阳性造血干细胞体外红系分化的培养基，属于造血干细胞的体外培养。

背景技术：

1、造血干/祖细胞(hematopoietic stem cells/progenitor cells，hscs)是血液系统中的成体干细胞，是一种异质性的群体，具有长期自我更新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能。随着科技的快速发展，hscs现已被广泛用于造血重建、基因治疗、肿瘤净化及免疫治疗等方面的研究；也被用于疾病的临床治疗中，如白血病、地中海贫血症、血友病等。在血液性疾病方面，2022年1月29日广西医科大学第一附属医院使用以造血干细胞为基础的基因疗法治愈了一名β地中海贫血症的儿童。2021年12月30日中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院也使用造血干细胞为基础的基因疗法治愈了一名重症地中海贫血患者(β0/β0型)。中南大学湘雅医院和解放军联勤保障部队第九二三医院也有同样的案例。vorbio公司公布的在研crispr/cas9基因编辑hspcs药物trem-cel(vor33)治疗急性髓系白血病(aml)患者的1/2a期临床试验数据显示效果良好，无副作用。在多种罕见病的治疗中，也有很大作用。orchard therapeutics公司研发管线otl-200是使用造血干细胞治疗异染性脑白质营养不良，该药物已在欧盟获批。同时，otl-201管线是一种利用造血干细胞治疗iiia型粘多糖贮积症(mps-iiia)，5名患者在接受治疗后脑脊液中的n-磺基葡糖胺磺水解酶水平已恢复正常。

2、目前临床获得造血干细胞的途径有3种，分别是取自骨髓、新生儿脐带血和人动员后外周血。其中新生儿脐带血来源的造血干细胞比其他两种来源的造血干细胞在干性方面表现更好。药物研发期间，需要在体外诱导造血干细胞进行红系分化，以检测造血干细胞改造后能否用于后续药物研发。但是，在体外，新生儿脐带血来源的造血干细胞往往比其他来源的造血干细胞更难红系分化，进而影响后续研发。

3、现有技术中的外周血和骨髓来源的造血干细胞体外红系分化的方法，一般不能使新生儿脐带血来源的造血干细胞在体外很好的红系分化。

技术实现思路

1、针对上述现有技术，本发明提供了一种用于脐带血cd34阳性造血干细胞体外红系分化的培养基，使用该培养基，可以使脐带血来源的cd34阳性造血干细胞成功实现红系分化。本发明的培养基成分简便，培养时易于操作。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：

3、一种用于脐带血cd34阳性造血干细胞体外红系分化的培养基，包括第一阶段培养基和第二阶段培养基，其中，所述第一阶段培养基是由以下浓度的组分组成的：scf，8～12ng/ml；il-3，8～12ng/ml；epo(人促红细胞生成素)，1.5～2.5u/ml；余量为stem cellsfemⅱ培养基；所述第二阶段培养基是由以下浓度的组分组成的：人ab血清，2％～5％(体积百分数)；epo，1.5～2.5u/ml；余量为stem cell sfemⅱ培养基。

4、优选的，所述第一阶段培养基是由以下浓度的组分组成的：scf，10ng/ml；il-3，10ng/ml；epo，2u/ml；余量为stem cell sfemⅱ培养基。

5、优选的，所述第二阶段培养基是由以下浓度的组分组成的：人ab血清，3％；epo，2u/ml；余量为stem cell sfemⅱ培养基。

6、所述stem cell sfemⅱ培养基是一种造血干细胞无血清培养基，是现有技术中的商品化培养基，可常规市场购买得到。所述scf，il-3，epo，人ab血清等，均为本领域的常用生长因子，可常规市场购买得到。

7、所述用于脐带血cd34阳性造血干细胞体外红系分化的培养基在培养脐带血cd34阳性造血干细胞中的应用。具体应用时，使用第一阶段培养基培养cd34阳性造血干细胞14天，然后采用第二阶段培养基继续培养，直到脱核完毕，每3～4天换液一次。

8、一种脐带血cd34阳性造血干细胞的体外红系分化的培养方法：使用第一阶段培养基培养cd34阳性造血干细胞14天，然后采用第二阶段培养基继续培养，直到脱核完毕，每3～4天换液一次。

9、进一步地，所述cd34阳性造血干细胞是使用密度梯度离心和磁珠分选的方式从脐带血中分离得到的。

10、本发明的用于脐带血cd34阳性造血干细胞体外红系分化的培养基，是在stemcell sfemⅱ培养基的基础上添加特定浓度的scf、il-3、epo、人ab血清等而成的，使用此培养基培养脐带血来源的cd34阳性造血干细胞，可使其成功红系分化，试验表明，体外分化培养第18天，活细胞数量可以扩增200倍左右；第14天，cd71阳性细胞比例可以达到约63％，第25天，cd235a阳性细胞比例可以达到约39％，hbf阳性细胞比例约38％。

技术特征：

1.一种用于脐带血cd34阳性造血干细胞体外红系分化的培养基，其特征在于：包括第一阶段培养基和第二阶段培养基，其中，所述第一阶段培养基是由以下浓度的组分组成的：scf，8～12ng/ml；il-3，8～12ng/ml；epo，1.5～2.5u/ml；余量为stem cell sfemⅱ培养基；所述第二阶段培养基是由以下浓度的组分组成的：人ab血清，2％～5％；epo，1.5～2.5u/ml；余量为stem cell sfemⅱ培养基。

2.根据权利要求1所述的用于脐带血cd34阳性造血干细胞体外红系分化的培养基，其特征在于，所述第一阶段培养基是由以下浓度的组分组成的：scf，10ng/ml；il-3，10ng/ml；epo，2u/ml；余量为stem cell sfemⅱ培养基。

3.根据权利要求1所述的用于脐带血cd34阳性造血干细胞体外红系分化的培养基，其特征在于，所述第二阶段培养基是由以下浓度的组分组成的：人ab血清，3％；epo，2u/ml；余量为stem cell sfemⅱ培养基。

4.权利要求1～3中任一项所述的培养基在培养脐带血cd34阳性造血干细胞中的应用。

5.根据权利要求44所示的应用，其特征在于：具体应用时，使用第一阶段培养基培养cd34阳性造血干细胞14天，然后采用第二阶段培养基继续培养，直到脱核完毕，每3～4天换液一次。

6.一种脐带血cd34阳性造血干细胞的体外红系分化的培养方法，其特征在于：使用权利要求1～3中任一项所述的培养基中的第一阶段培养基培养cd34阳性造血干细胞14天，然后采用第二阶段培养基继续培养，直到脱核完毕，每3～4天换液一次。

7.权利要求6所述脐带血cd34阳性造血干细胞的体外红系分化的培养方法，其特征在于：所述cd34阳性造血干细胞是使用密度梯度离心和磁珠分选的方式从脐带血中分离得到的。

技术总结
本发明公开了一种用于脐带血CD34阳性造血干细胞体外红系分化的培养基，包括第一阶段培养基和第二阶段培养基，其中，所述第一阶段培养基是由以下组分组成的：SCF，8～12ng/ml；IL‑3，8～12ng/ml；EPO，1.5～2.5U/ml；余量为Stem cell SFEMⅡ培养基；所述第二阶段培养基是由以下组分组成的：人AB血清，2％～5％；EPO，1.5～2.5U/ml；余量为Stem cell SFEMⅡ培养基。使用本发明的培养基培养脐带血来源的CD34阳性造血干细胞，试验表明，体外分化培养第18天，活细胞数量可以扩增200倍；第14天，CD71阳性细胞比例可以达到63％，第25天，CD235a阳性细胞比例可以达到39％，HbF阳性细胞比例38％。

技术研发人员：蒋金河,张癸荣,邢菲菲,张星,王凤江
受保护的技术使用者：山东银丰生命科学研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16