脲原体分型检测试剂盒的制作方法

本发明涉及生物检测技术，尤其是涉及一种脲原体分型检测试剂盒。

背景技术：

1、目前，研究认为解脲脲原体（ureαplαsmα ureαlyticum，uu）与非淋菌性尿道炎（non-gonorrheαl urethritis, ngu）高度相关，而微小脲原体（ureαplαsmα pαrvum，up）在男性尿道是正常菌群。临床生殖道标本中up比uu更为常见，检出率远高于uu，up常见于临床无症状携带，多数人认为up属于正常菌群。因而，精确区分出解脲脲原体uu和微小脲原体（up）就显得尤为必要。

2、现有脲原体的检测方法主要包括培养法、免疫学方法、分子生物学方法。传统的培养法是基于脲原体中的脲酶能够分解尿素产生氨，进而使培养基中的ph升高变色，依此来检测脲原体，但不能区分uu和up。为此，申请人提出了一种能够区分uu和up的培养方法，即利用mn2+和mg2+对uu、up脲酶的不同抑制作用实现了uu和up的区分检测，但是该方法仍然属于培养法，需要培养24h～48h才可出结果，检测周期较长，无法满足门诊高通量样本的需求。

3、免疫学方法检测脲原体分两大类，即检测抗体和检测抗原，这又分微孔板式的酶联免疫吸附法和胶体金法。酶联免疫吸附法操作稍显复杂，胶体金法则操作简单，一般20分钟就可出结果。但这两种方法只是采用了解脲脲原体与微小脲原体分开前的名字，统称为解脲脲原体，并不能实现uu和up的区分检测。

4、分子生物学法主要有单引物pcr、多引物的多重pcr和基因测序三种，但单引物pcr也不能区分uu和up；多引物的多重pcr和基因测序能够区分uu和up，但操作过于复杂，不适宜临床使用。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提出了一种脲原体分型检测试剂盒，不仅提高脲原体的精准度，还能实现uu和up的区分检测，而且操作简单方便，20公分即可出结果，能够满足临床高通量样本的快速检测需求。

2、为实现上述目的，本发明采取下述技术方案：

3、本发明所述的脲原体分型检测试剂盒，包括脲酶反应体系、脯氨酸氨基肽酶反应体系、亮氨酸氨基肽酶反应体系、α-葡萄糖苷酶反应体系、脲酶i反应体系和含有显色剂的显色液，其中，所述脲酶反应体系的酶底物和脲酶i反应体系的酶底物均为尿素或尿素衍生物；脲酶i反应体系中还添加有mn2+；所述显色剂为4-二甲氨基肉桂醛及其衍生物中的任意一种。

4、有益效果是：本发明首次提出了基于4-二甲氨基肉桂醛和尿素（或尿素衍生物，尿素衍生物为羟甲基尿素、磷酸尿素等）的显色检测脲酶，完全不受样本自身ph的影响，提高脲酶检测结果的精准性；

5、本发明首次提出将脲酶、脯氨酸氨基肽酶、亮氨酸氨基肽酶、α-葡萄糖苷酶及脲酶i相结合，实现了uu和up的区分检测，提高精准度；

6、本发明的试剂盒能操作简单，能够实现快速检测，检测时间可控制在20min以内，能够满足高通量样本的快速检测需求。

7、本发明的结果判读方式是脲酶指标为阳性时说明存在脲原体，阴性表明无脲原体感染；α-葡萄糖苷酶和脯氨酸氨基肽酶同时阳性，或者α-葡萄糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶同时阳性表明有微小脲原体（up）；脲酶i阳表明有样本中存在解脲脲原体（uu），进而实现了uu和up的区分检测，对临床上避免因up感染造成的过度医疗具有重要的指导意义。

8、优选的，所述脲酶i反应体系中mn2+的浓度为0.001～0.1mg/l。

9、优选的，所述显色剂的含量为0.1%～5%。在实际配制时，显色剂采稀盐酸（浓度为0.1～5 m）、稀硫酸或硫酸氢钠溶液）配制，为显色反应提供酸性环境。其中，显色剂的浓度可在0.1 mg/ml～5.0 mg/ml。

10、优选的，所述脯氨酸氨基肽酶反应体系的酶底物为含有色原的l-脯氨酸，其浓度为0.5mg/ml～5mg/ml；所述亮氨酸氨基肽酶反应体系的酶底物为含有色原的l-亮氨酸，其浓度为0.5mg/ml～5mg/ml；所述α-葡萄糖苷酶反应体系的酶底物为含有色原的葡萄糖苷，其浓度为0.5mg/ml～5mg/ml；所述脲酶反应体系的酶底物和脲酶i反应体系的酶底物的浓度为1mg/ml～10mg/ml。

11、更优选的，所述含有色原的l-脯氨酸中的色原为对硝基苯胺、4-甲氧基-β-萘胺、β-萘胺或7-氨基-4-甲基香豆素及其衍生物中的任意一种；所述含有色原的亮氨酸中的色原为对硝基苯胺、4-甲氧基-β-萘胺、β-萘胺或7-氨基-4-甲基香豆素及其衍生物中的任意一种；所述含有色原的葡萄糖苷中的色原为吲哚酚、吲哚酚衍生物、萘酚或萘酚衍生物中的任意一种。

12、更优选的，所述含有色原的葡萄糖苷为5-溴-6-氯-3-吲哚-α-d-葡萄糖苷、6-溴-3-吲哚-α-d-葡萄糖苷、6-氯-3-吲哚-α-d-葡萄糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚-α-d-葡萄糖苷或5-溴-4-氯-3-吲哚-n-甲基-α-d-葡萄糖苷。

13、优选的，所述脯氨酸氨基肽酶反应体系的ph为8.0～9.0；所述α-葡萄糖苷酶反应体系的ph为4.0～6.0；所述亮氨酸氨基肽酶反应体系的ph为6.0～7.0；所述脲酶反应体系和脲酶i反应体系的ph为6.0～8.0。

14、在实际配制时，脲酶反应体系、脲酶i反应体系、脯氨酸氨基肽酶反应体系、α-葡萄糖苷酶反应体系和亮氨酸氨基肽酶反应体系均采用生物缓冲液配制。其中，生物缓冲液为磷酸盐缓冲液、tris-hcl缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或na2hpo4-柠檬酸缓冲液中任意一种或两种以上的组合。更具体地，脯氨酸氨基肽酶、脲酶反应体系和脲酶i反应体系反应体系优选柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，α-葡萄糖苷酶反应体系采用含有固紫b盐的na2hpo4-柠檬酸缓冲液；亮氨酸氨基肽酶反应体系采用tris-hcl缓冲液配制。

15、优选的，本发明所述的脲原体分型检测试剂盒，还包括检测卡，所述检测卡具有分别包被有脲酶反应体系、脯氨酸氨基肽酶反应体系、亮氨酸氨基肽酶反应体系、α-葡萄糖苷酶反应体系和脲酶i反应体系的反应孔。有益效果是：本发明试剂盒的成品为检测卡，方便检测和运输。

16、更优选的，每个所述反应孔处的试剂垫为滤纸、棉浆纸、玻璃纤维垫或聚酯纤维垫，多个反应孔的试剂垫间隔设置。

17、优选的，本发明的脲原体分型检测试剂盒，还包括样本稀释液。在实际使用时，样本稀释液优选0.9%的氯化钠。

18、与现有技术相比，本发明首次提出了基于4-二甲氨基肉桂醛和尿素的显色检测脲酶的方法，结果判读完全不受样本自身ph的影响，提高脲酶检测结果的精准性，具有较低的检测限，灵敏度高，克服了传统方法受样本自身ph影响而影响判读结果准确度的缺陷。本发明首次提出将脲酶、脯氨酸氨基肽酶、亮氨酸氨基肽酶、α-葡萄糖苷酶及脲酶i相结合区分判读uu和up。具体地，当脲酶指标为阳性时说明存在脲原体，阴性表明无脲原体；α-葡萄糖苷酶阳和脯氨酸氨基肽酶阳同时阳性，或者α-葡萄糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶同时阳表明有up；脲酶i阳表明有样本中存在uu，进而实现了uu和up的区分检测，对临床上避免因up感染造成的过度医疗具有重要的指导意义。