一种联产水解蛋黄肽与磷脂DHA的方法

本发明属于生物酶解，具体涉及一种联产水解蛋黄肽与磷脂dha的方法。

背景技术：

1、水解蛋黄粉是提取自鸡蛋黄的一种功能性物质，可进一步通过蛋白酶解、超声加盐、离心分离、喷雾干燥等生物与物化联合的方法，将其提取并制造成小肽的产品。2008年9月9日水解蛋黄粉正式被批准为新资源食品，可在一般食品中使用。水解蛋黄粉中的蛋白质及多肽还能够促进骨骼的成长和健康以及抗炎抗氧化等生物活性功能，在疾病预防中有重要作用。也具有更容易消化吸收不会产生过敏原或皮炎等特点。因此，水解蛋黄粉可广泛地应用于食品、保健品和药品等相关领域，使用人群也非常广泛，在婴幼儿及青少年儿童，中老年骨骼保健品中均可添加，具有很好工业化应用前景。

2、磷脂dha具有独特的生物活性和功能作用，其生物利用度相对较高，人体吸收率远高于甘油酯dha和乙酯dha。此外，磷脂结合dha后，可以提高dha的抗氧化性。另外，在一些研究中，磷脂dha表现出了一系列益处，磷脂dha可以增强对健康有益的亲水性和疏水性化合物，如细胞分化剂、抗癌化合物、抗肥胖化合物的作用。给予高血脂患者磷虾油治疗，可以显著降低总胆固醇，低密度脂蛋白和甘油三酯，管理高血脂症。还可以减轻经期疼痛，治疗精神疾病，降低痴呆风险，维持较高比例的血清磷脂dha有利于降低心血管风险，改善认知功能缺损等。还具有促进婴儿视网膜发育、降低患神经性系统疾病风险、抗肿瘤等功效，可用作保健品及食品营养强化剂等。

3、目前市场上的水解蛋黄粉多以脱脂蛋黄粉为原料，进行酶解反应获得。虽然这样会使得油脂提取的更加彻底，但是这需要利用有机试剂进行提取，费时费力，生产成本高，也会导致脱脂蛋黄粉中蛋白质变性，形成结块不易水解，需要进一步的破坏和处理才行。因此，亟需开发一种生产成本低、周期短，易控制的生产工艺。

技术实现思路

1、针对现有方法中，蛋白酶解前需要对蛋黄粉进行第一步的萃取提油，且过程中被油层包埋的脂类大蛋白变性严重，使得后一步的蛋白酶解比较困难，并针对蛋白质析出后酶水解过度，形成小肽和氨基酸类等物质占比过高的问题，本发明开发了一种联产水解蛋黄肽与磷脂dha的方法，可以实现一步酶解提取多种活性物质，绿色低碳污染性小，而且可以减少成本与有机试剂的浪费与污染，适合工业化生产。

2、为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种联产水解蛋黄肽与磷脂dha的方法，包括如下步骤：

4、(1)预处理：将蛋黄粉和磷酸缓冲溶液混合后，超声后剪切处理，之后加入水解辅助剂，并调节ph为7～10，优选为8，得到预处理底物；所述水解辅助剂为硫酸盐、亚硫酸盐或硫代硫酸盐中的一种或几种；

5、(2)水解：向所述预处理底物中添加蛋白酶，经过酶水解反应、灭酶之后，得到粗提物，之后对所述粗提物进行分层分离，在上层得到磷脂型dha，在下层得到水解蛋黄肽。

6、优选的，步骤(1)中所述的蛋黄粉为纯原蛋黄粉、大豆蛋黄粉或磷脂型dha蛋黄粉中的一种或几种。更优选的，所述磷脂型dha蛋黄粉来自于以dha藻渣或藻粉喂食的鸡所产鸡蛋。

7、优选的，所述磷脂型dha蛋黄粉由如下方法获得：

8、将以dha藻渣或藻粉喂食的鸡所产鸡蛋的蛋黄分离出，并喷雾干燥，得到所述磷脂型dha蛋黄粉。

9、优选的，步骤(1)中所述的蛋黄粉与所述的磷酸缓冲溶液的质量比为1:5～10。

10、优选的，步骤(1)中所述的磷酸缓冲液的浓度为10～50mmol/l。

11、优选的，步骤(1)中所述的硫酸盐为硫酸钠或硫酸氢钠，所述的亚硫酸盐为亚硫酸氢钠或亚硫酸钠，所述的硫代硫酸盐为硫代硫酸钠。

12、优选的，步骤(1)中所述的蛋黄粉与所述的水解辅助剂的质量比为100:2～5。

13、优选的，步骤(1)中所述的超声的功率为65～325w，时间为10～30min，所述的剪切为采用剪切机剪切，时间为0.5～5min。

14、优选的，步骤(2)中所述的蛋白酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶中的一种或几种。更优选的，所述的蛋白酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶和风味蛋白酶的混合，且中性蛋白酶、碱性蛋白酶和风味蛋白酶的质量比为2:1:0.5。在此条件下水解的产物，多肽含量及产物口味综合最好，更加适于食品应用。

15、优选的，步骤(2)中蛋白酶的用量为所述预处理底物总质量的2％(w/w)～6％(w/w)。

16、优选的，步骤(2)灭酶之后通过离心处理得到粗提物，所述离心的转速为8000～12000r/min，时间为10～30min。

17、优选的，步骤(2)中所述的灭酶的方法为：煮沸。

18、优选的，步骤(2)中水解蛋黄肽的获得方法为：将下层液脱色处理后冷冻干燥。

19、优选的，所述的脱色处理的方法为活性炭脱色、大孔树脂脱色或葡聚糖凝胶脱色中的一种或几种。

20、优选的，所述的冷冻干燥为采用压盖型冷冻干燥机，冷阱温度为-60℃～-80℃，真空度为0～2pa条件下冷冻干燥。

21、优选的，步骤(2)中磷脂型dha的获得方法为：将上层液旋转蒸发，所述旋转蒸发的温度为60℃～80℃，时间为5～20min。

22、本发明的有益效果在于：

23、(1)本发明提供了一种直接将蛋黄粉进行酶解，一步法获得磷脂dha和蛋黄肽的方法，该方法无需有机溶剂提油，过程温和，绿色安全；酶也可以重复利用，避免了浪费与污染，符合低碳环保的理念。

24、(2)本发明进一步提供了一种制备磷脂dha的方法，该方法通过dha藻渣和藻粉喂鸡，通过体内富集进而获得含有磷脂型dha的鸡蛋，把鸡蛋喷雾干燥成磷脂型dha蛋黄粉，随后可以从这种蛋黄粉中提取得到磷脂型dha。且本发明中提取磷脂dha的方法不是有机溶剂萃取法，无有机溶剂残留；

25、(3)本发明提供了一种物化方法预处理联合酶解处理的加工方法，高效获得了蛋黄多肽，其相对分子量在小于10000da的肽占比大于95％，小于2000da的肽占比大于80％，达到国家肽类的一级标准，水解度大于10％，蛋白质含量大于30g/l，多肽含量大于9g/l,提取蛋黄油率大于75％，磷脂dha中比例大于10％。

26、由于蛋白中二硫键含量的改变对于蛋白酶解特性以及其酶解产物的功能活性具有显著影响，而可作为食品添加剂的硫酸盐、亚硫酸盐或硫代硫酸盐能破坏蛋白质的二硫键。这类盐与蛋白质间存在结合作用，两者结合的主要作用力是氢键和范德华力，这类盐通过还原蛋白中的二硫键形成磺酸盐从而改变蛋白构象。超声剪切和硫酸盐、亚硫酸盐或硫代硫酸盐分别可通过物理的办法和化学的办法打开蛋白质的二硫键，增加游离巯基含量和表面疏水性，有一定的互补性。本方法中所采用的超声剪切会引起空化作用，影响蛋白质构象的变化，使更多的蛋白质和多肽吸附在界面上，有利于提高蛋白质的溶解性；而添加的硫酸盐、亚硫酸盐或硫代硫酸盐会破坏蛋白的二硫键，使蛋白质的机构更加松散，疏水性基团得到更好的暴露，使得蛋白与油脂分离析出，增加蛋白质的溶解度，更有利于酶促反应。本发明所提供的方法科学有效，所制备的产品符合要求。