一种利用光热材料光热效应快速扩增mecA抗性基因的光热环介导等温扩增方法

本发明涉及一种快速扩增β-内酰胺类抗生素抗性基因meca的光热环介导等温扩增方法，属于分析检测。

背景技术：

1、抗生素抗性基因是导致细菌产生抗生素耐药性的“元凶”，它是自然存在的、编码抵抗抗生素功能的基因片段，因其具备生物活性、迁移转化途径复杂、种类多样等特点，被视作一种新型环境污染物。抗性基因受人类活动影响，环境中抗生素选择压力持续存在，抗性基因在环境中的丰度不断升高，从而导致耐药微生物的“肆虐”。其中，β-内酰胺类抗生素抗性基因是能使细菌产生对β-内酰胺类抗生素的抗性的一类抗性基因，随环境、食品跨宿主跨地区传播，造成食品安全风险，同时导致临床治疗中抗菌药物的选择受限，严重威胁人类健康。因此，迫切需要开发β-内酰胺类抗生素抗性基因的现场快速检测方法。

2、等温扩增技术可以在恒定温度下进行扩增反应，在体外实现扩增目的核酸片段，相较于聚合酶链式反应技术(pcr)不需要依赖热循环仪。其中，环介导等温扩增在60～65℃的恒温条件下40～45min即可实现目标基因片段扩增，且灵敏度较高，广泛应用于核酸扩增领域检测各类目标物。

3、光热扩增，也称光子扩增，通过将各种光热纳米材料加入扩增体系中，用激光或发光二极管(led)等作为光源，区别于传统的介质浴，热源与扩增体系直接接触，实现体积加热，核酸扩增提供所需的能量。jalili等介绍了一种基于金纳米薄膜的微流控芯片和等离子体光热循环器的快速液滴光子pcr系统，在13分钟内实现30个从60℃到95℃的热循环(sci rep 2021,11,23338)，liu等引入苯胺(tpp)修饰的au纳米粒子(au-tpp)作为加热元件来提高原位滚环扩增(rca)的特异性，用于直接原位检测mrna(biosensors andbioelectronics 2021,192，113507)，光子扩增降低了能耗，缩短了操作时间，提高了扩增效率，已与pcr，lamp，rca扩增技术联用，并显示出良好的效果，是一种很有前途的现场检测平台。目前尚未有利用光热扩增技术检测抗生素抗性基因的报道。

技术实现思路

1、技术问题：

2、现有meca抗性基因环介导等温扩增方法具有以下局限性：依赖水浴、金属浴等不易携带设备；扩增时间较长，扩增效率有待提高。

3、技术方案：

4、本发明的第一个目的是，提供一种利用光热材料光热效应快速扩增meca抗性基因的光热环介导等温扩增的方法，光热环介导等温扩增体系包括以下组分：引物组、可可粉提取物及dna模板，利用808nm激光光源照射激发可可粉提取物的光热效应进而以高效率体积加热方式提供环介导等温扩增所需温度，实现等温扩增体系中meca抗性基因的环介导等温扩增。

5、作为一种可选的实施方式，所述可可粉提取物由可可粉进行脱脂、研磨预处理后得到。

6、进一步的作为一种可选的实施方式，所述脱脂包括使用正戊烷萃取脱脂，所述研磨后的可可粉颗粒粒径不低于30目。

7、作为一种可选的实施方式，所述光热环介导等温扩增体系中，可可粉提取物以浓度为100mg/mldepc水的可可粉提取物溶液的形式加入。depc水是用depc(diethylpyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的超纯水(一级水)，无色液体。经检测不含杂质rna、dna和蛋白质。depc水可以用于rna沉淀的溶解，含有rna的各种反应体系如反转录、sirna的退火等，以及其它各种要求无rnase、dnaase和proteinase的反应体系。

8、作为一种可选的实施方式，所述可可粉提取物溶液在该光热环介导等温扩增体系中的体积浓度为4％～8％v/v。

9、作为一种可选的实施方式，所述dna模板是指含目标基因的基因组dna，所述基因组dna的提取方法包括dna提取试剂盒提取法、吸附柱法、磁珠法、ctab法任意一种。

10、作为一种可选的实施方式，所述光热环介导等温扩增体系中，dna模板的浓度为4％v/v。

11、作为一种可选的实施方式，所述引物组包括两个外部引物f3和b3、两个内部引物fip和bip，及两个环引物loop f和loop b。

12、作为一种可选的实施方式，所述光热环介导等温扩增体系中，两个外部引物f3和b3的浓度为4％v/v，两个内部引物fip和bip的浓度为2％～10％v/v，两个环引物loop f和loop b的浓度为0～4％v/v。

13、作为一种可选的实施方式，所述光热环介导等温扩增体系还包括以下组分：bsa、mgso4、thermo pol缓冲液、dntps、甜菜碱、bst 3.0dna聚合酶及ddh2o。

14、作为一种可选的实施方式，所述808nm激光的照射参数为功率0.574～1.36w，照射时间10～60min。

15、本发明的第二个目的是，提供一种检测meca抗性基因的方法，该方法通过夹心型侧流层析核酸试纸法表征扩增产物，所述扩增产物为如权利要求1-9任一所述的方法获得的扩增产物。

16、作为一种可选的实施方式，本发明提供一种利用光热材料光热效应实现meca抗性基因光热环介导等温扩增的方法，并利用该方法进行meca抗性基因的检测，该方法包括如下步骤：

17、(1)引物序列设计：

18、根据环介导等温扩增原理，针对目标基因序列六个不同的区域设计扩增引物组，所述引物组包括两个外部引物(f3和b3)、两个内部引物(fip和bip)和两个环引物(loop f和loop b)。

19、作为一种可选的实施方式，所述步骤(2)中的引物序列可根据目标基因序列不同位置设计不同序列的引物组。

20、(2)基因组dna提取：

21、培养含有目标基因(meca)的菌株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)24h，提取含目标基因的基因组dna，具体方法为：利用dna提取试剂盒提取基因组dna，所述试剂盒包括buffer ga、proteinase k、rnase a、buffer gb、buffer pw、elution buffer、fastpuregdna mini columnsⅲ、collection tubes。

22、作为一种可选的实施方式，所述步骤(2)中的基因组dna提取方法还可为吸附柱法、磁珠法、ctab法等任意一种。

23、(3)光热材料制备：

24、采购可可粉，用去离子水洗涤三次以去除杂质和残留物，加入正戊烷萃取脱脂。采用电动谷物研磨机研磨脱脂后的可可粉，过30目筛，将处理后的可可粉用depc水配置成100mg/ml溶液作为光热环介导扩增体系所需要素备用。

25、(4)光热环介导等温扩增体系构建：

26、以步骤(2)提取的基因组dna作为模板，构建光热环介导等温扩增体系，该扩增体系包括以下组分：步骤(1)所述引物组、可可粉提取物(即步骤(3)制得的可可粉提取物溶液)、bsa、mgso4、thermo pol缓冲、dntps、甜菜碱、bst 3.0dna聚合酶、ddh2o和步骤(2)中提取的dna模板。

27、作为一种可选的实施方式，保持终体积为25μl的前提下，所述光热环介导扩增体系各成分浓度和反应体积如下表1所示：

28、表1本发明光热环介导等温扩增体系各成分浓度和反应体积

29、

30、(5)激光手电激发：

31、利用808nm激光手电照射步骤(3)中构建的光热环介导扩增体系，激发光热环介导扩增体系中的光热材料提供环介导等温扩增所需温度。

32、作为一种可选的实施方式，所述808nm激光照射参数为功率0.574～1.36w，照射时间10～60min。

33、(6)扩增产物分析：

34、对步骤(5)中的扩增产物进行琼脂糖核酸凝胶电泳分析。

35、当样品中不含meca基因时，凝胶电泳图像显示无弥散型条带。

36、当样品中含有meca基因时，凝胶电泳图像显示出弥散型条带。

37、本发明的利用光热材料光热效应快速扩增meca抗性基因的光热环介导等温扩增原理(如图1所示)为：可可粉含有酚类结构，存在共轭效应。这种类型的分子轨道既存在共轭π轨道，又存在π*轨道。由于轨道中π电子的轨道能隙很小，因此这些电子在光源照射下很容易移动到π*轨道。当激发的π电子弛豫回基态时，一部分能量以热量的形式释放。简单来说，可可粉在近红外激光照射下，能够升温。因此可可粉提取物替代了传统等温扩增所需的水浴、金属浴等升温设备，为环介导等温扩增提供适宜的温度环境。可可粉提取物均匀分散于扩增体系中，作为热源与扩增体系直接接触，热源与扩增体系的接触面积大于传统扩增的介质浴加热，因此能够实现目标基因的快速扩增。环介导等温扩增产物是具有不同个数茎环结构、多环花椰菜样结构的dna的混合物，因此凝胶电泳图象显示为弥散型条带。

38、有益效果：本发明提供的扩增方法，应用可可粉光热升温特性，3min左右即可升温到稳定温度，并且光热材料与环介导扩增体系直接接触，较大的接触面积和均匀的分散性实现体积加热，比传统水浴、金属浴升温速度快，升温效果好，15分钟内即可实现目标dna的高效扩增，扩增效率更高。