一种猪全转录因子激活文库构建方法及其筛选调控OCT4基因的转录因子的方法

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种猪全转录因子激活文库构建方法、一种细胞系的构建方法以及筛选调控oct4基因的转录因子的方法。

背景技术：

1、crispr/cas9介导的文库筛选技术主要基于crispr/cas9基因编辑技术，该文库筛选技术已经在生物学和医学等领域带来了创造性的变革。crispr/cas9筛选文库分为crispr敲除文库、crispr激活文库以及crispr抑制文库，这些文库在功能缺失型筛选和功能获得型筛选中发挥着重要作用。

2、在研究基因表达的过程中，转录因子对基因的表达调控起着至关重要的作用，因此激活转录因子的表达，可以判断出该转录因子对基因是激活作用还是抑制作用。目前基因组规模的功能获得型激活筛选主要依赖cdna文库过表达系统，但该系统仍然存在很多缺陷:筛选效率较低，文库构建成本较高，文库构建复杂，cdna传递到靶细胞有一定的困难和局限、不能利用单条cdna上调异构体的表达等。现有技术可以对转录因子进行激活并进行筛选，然而，提高筛选的效率、降低文库构建费用和难度、将载体工具更高效的传递到靶细胞、激活基因异构体的表达等仍是目前有待解决的问题。

技术实现思路

1、本发明公开了一种猪全转录因子激活文库构建方法及其筛选调控oct4基因的转录因子的方法。解决了目前基因组规模的功能获得筛选方法在很大程度上局限于cdna文库过表达系统的使用，而合成和使用聚合cdna文库的成本高且复杂的问题。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种基于crispr猪全转录因子激活文库构建的方法，所述方法包括如下步骤：

4、(1)参照人转录因子信息结合ncbi数据库中猪基因组信息以及g:profiler数据库，确定猪的转录因子；

5、(2)转录因子确定后，再确定转录因子的启动子区域并对序列进行提取，进而对sgrna进行设计并筛选，共筛选出的5056条sgrna；

6、(3)将筛选出的5056条sgrna序列进行合成，并利用同源重组的方式将sgrna克隆到慢病毒载体上，获得克隆后的sgrna文库。

7、进一步的，所述步骤(2)中sgrna的设计方法为在ncbi的gene数据库中确定转录因子的tss，根据tss位置信息在猪基因组中利用promotor.java脚本提取其上游3000bp至下游50bp的碱基序列，并利用sgrna设计软件在此区域内设计。

8、进一步的，所述步骤(3)中sgrna序列合成长度为20nt，所述慢病毒载体为plenti_sgrna(ms2)_zeo，所述慢病毒载体的抗性基因为博来霉素。

9、一种细胞系的构建方法，所述细胞系既表达oct4启动子驱动的egfp，又表达dcas9-sam系统元件，所述构建方法如下：

10、(1)将pogn2载体利用asei单酶切处理，通过同源重组的方式将同源臂序列ha连入asei单酶切处理后的pogn2载体，获得目的载体质粒pogn2-ha；

11、(2)将质粒pogn2-ha经bsmbi酶切后获得线性化敲入模板；

12、(3)利用电穿孔和脂质体转染方式将线性化敲入模板与rnp复合体转入pk15细胞，获得猪rosa26位点敲入poct4-egfp细胞系；

13、(4)将表达dcas9-sam系统元件的质粒利用慢病毒进行包装；

14、(5)利用包装了表达dcas9-sam系统元件的质粒的慢病毒对猪rosa26位点敲入poct4-egfp细胞系进行感染，得到既表达oct4启动子驱动的egfp，又表达dcas9-sam系统元件的细胞系。

15、一种利用猪全转录因子crispra文库筛选调控oct4基因的转录因子的方法，所述方法为利用慢病毒sgrna文库，对既表达oct4启动子驱动的egfp，又表达dcas9-sam系统元件的细胞系进行感染，筛选出对oct4的表达有调控作用的转录因子。

16、进一步的，所述慢病毒sgrna文库为权利要求1中所述的克隆后的sgrna文库。

17、现有的关于猪的筛选文库只有全基因组敲除文库，本发明在此基础上首创转录因子激活文库，且文库sgrna设计有详细合理的筛选方法。同时构建了目前并未构建的既表达oct4启动子驱动的egfp，又表达dcas9-sam系统元件的细胞系，将针对筛选调控oct4表达的转录因子的荧光报告系统与dcas9-sam系统进行结合。

18、利用crispr激活文库可以在内源性位点上系统的对基因的表达进行调控，同时更有着应用范围广、编辑效果假阳性比率较低以及靶点命中率高等优点。同时据目前的研究所知，已经在猪中全转录因子激活文库尚没有被建立，本研究构建的全转录因子激活文库，可为猪这一物种筛选和研究转录因子的功能及调控网络提供有力的工具。

技术特征：

1.一种基于crispr猪全转录因子激活文库构建的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2中sgrna的设计方法为在ncbi的gene数据库中确定转录因子的tss，根据tss位置信息在猪基因组中利用promotor.java脚本提取其上游3000bp至下游50bp的碱基序列，并利用sgrna设计软件在此区域内设计。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3中sgrna序列合成长度为20nt，所述慢病毒载体为plenti_sgrna(ms2)_zeo，所述慢病毒载体的抗性基因为博来霉素。

4.一种细胞系的构建方法，其特征在于，所述细胞系既表达oct4启动子驱动的egfp，又表达dcas9-sam系统元件，所述构建方法如下：

5.一种利用猪全转录因子crispra文库筛选调控oct4基因的转录因子的方法，其特征在于，所述方法为利用慢病毒sgrna文库，对既表达oct4启动子驱动的egfp，又表达dcas9-sam系统元件的细胞系进行感染，筛选出对oct4的表达有调控作用的转录因子。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述慢病毒sgrna文库为权利要求1中所述的克隆后的sgrna文库。

技术总结
本发明公开了一种猪全转录因子激活文库构建方法及其筛选调控OCT4基因的转录因子的方法，属于分子生物学领域。本发明解决了目前基因组规模的功能获得筛选方法在很大程度上局限于cDNA文库过表达系统的使用，而合成和使用聚合cDNA文库的成本高且复杂的问题。本发明为了筛选猪中调控OCT4表达的转录因子，构建了猪全转录因子CRISPR激活文库，具体技术方案如下：首先筛选猪的转录因子，针对转录因子设计合成sgRNA后构建慢病毒sgRNA文库，同时构建既表达OCT4启动子驱动的EGFP，又表达dCas9‑SAM系统元件的细胞系，最后利用构建好的sgRNA文库感染该细胞系，再通过sgRNA富集来筛选调控OCT4表达的转录因子。本研究所述的方法可为猪这一物种筛选和研究转录因子功能及调控网络提供有力的工具。

技术研发人员：牟彦双,刘忠华,梁英娟,王金鹏,耿立爽,姚晓霞
受保护的技术使用者：东北农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/25