核酸构建体及其用途的制作方法

本发明涉及基因治疗。具体涉及用于年龄相关性黄斑变性(amd)例如湿性amd的核酸构建体。

背景技术：

1、年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，amd)，也称为年龄相关的黄斑变性，是一种与年龄相关的、进行性、不可逆性中心视力丧失的疾病，是全球60岁以上老年人致盲的主要原因。晚期amd在临床上主要分为两大类：干性和湿性。其中干性amd以脉络膜下玻璃膜疣沉积和形成地图状萎缩为主要特点。湿性amd以脉络膜新生血管化(choroidal neovascularization,cnv)、视网膜下腔渗出为特征。新生血管性amd(neovascular amd,namd)，仅占amd总数的10％，但其致盲患者数占amd致盲总人数的90％。

2、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，vegf)是调控血管生成和血管渗漏的关键因子，在脉络膜新生血管形成过程中有着重要作用。vegf属于血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，pdgf)超家族中的成员。vegf家族成员包括vegf-a、vegf-b、vegf-c、vegf-d及胎盘样生长因子(placental-like growth factor，plgf)。其中，vegf-a与其受体vegfr-2结合后促使下游大量蛋白活化，导致血管内皮细胞生长、分化和增生，血管通透性增加。此外，vegf-a也是重要的炎性细胞趋化因子。目前vegf的病理性表达已经被证实为namd的重要致病机制之一。

3、大量临床试验和实践证明玻璃体腔内注射抗vegf药物能够有效稳定和改善患者视力，短期疗效显著，成为namd患者的一线治疗方案。目前的抗vegf治疗药物包括雷珠单抗(ranibizumab；genentech，inc.)、eylea(aflibercept；regeneron pharmaceuticals，inc.)、beovu(brolucizumab；novartis，inc.)以及康柏西普(conbercept；成都康弘生物科技有限公司)等。

4、但抗vegf治疗仍存在一些实际的局限性，包括药物的高成本、需要频繁的玻璃体内注射、可能发生并发症、不完全应答和/或某些患者无法维持应答。因此，寻找更有效、更持久的治疗方法，对减少社会和个人的治疗负担有着重要作用。

5、此外，目前市售的或处于临床实验阶段的抗vegf药物大多以1:1甚至2:1的比率结合vegf，其治疗效果有限。因此，亟待开发一种能够以更高的结合比例结合vegf的抗vegf的更持久的药物。

技术实现思路

0、发明概述

1、为解决上述问题，本发明通过在同一表达载体中包含编码融合的多种抗vegf分子的核苷酸序列，然后将包含该表达载体的病毒颗粒转导到人视觉细胞中，从而在视觉细胞中持续表达高水平的抗vegf分子。本发明的技术方案能够更高效的阻断vegf/vegfr的结合，从而有效地治疗年龄相关的黄斑变性。

2、相应地，在第一方面，本发明提供了一种核酸构建体例如表达载体，所述核酸构建体包含一种或多种编码vegf结合区的核苷酸序列，例如编码第一vegf结合区的第一核苷酸序列和/或编码第二vegf结合区的第二核苷酸序列，其中所述第一vegf结合区和/或第二vegf结合区各自独立地选自衍生自抗vegf抗体的抗原结合片段和衍生自vegf受体(vegfr)的vegf结合片段，所述vegf结合片段包含vegfr的结构域2和结构域3(d2/3)。

3、本发明还提供了一种核酸构建体例如表达载体，所述核酸构建体包含编码第一vegf结合区的第一核苷酸序列和编码第二vegf结合区的第二核苷酸序列，其中所述第一vegf结合区和第二vegf结合区各自独立地选自衍生自抗vegf抗体的抗原结合片段和衍生自vegf受体(vegfr)的vegf结合片段，所述vegf结合片段包含vegfr的结构域2和结构域3(d2/3)。

4、在一些实施方案中，衍生自抗vegf抗体的抗原结合片段可以选自scfv、fab、fab’、f(ab')2、fd、fd’、fv、ds-scfv和dab。

5、在一些实施方案中，所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列通过编码接头的核苷酸序列连接。

6、在一些实施方案中，所述第一vegf结合区为衍生自抗vegf抗体的抗原结合片段(例如scfv)，且所述第二vegf结合区为衍生自另一不同的抗vegf抗体的抗原结合片段(例如scfv)。

7、在一些实施方案中，所述第一vegf结合区为衍生自抗vegf抗体的抗原结合片段(例如scfv)，且所述第二vegf结合区为衍生自vegfr的vegf结合片段。

8、在上述核酸构建体的一些实施方案中，所述核酸构建体还包含编码第三vegf结合区的第三核苷酸序列，所述第三vegf结合区选自衍生自抗vegf抗体的抗原结合片段(例如scfv)和/或衍生自vegfr的vegf结合片段，所述vegf结合片段包含vegfr的d2/3。

9、在一些优选的实施方案中，所述第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列之间通过编码接头的核苷酸序列连接。

10、在一些实施方案中，所述第一vegf结合区为衍生自抗vegf抗体的抗原结合片段(例如scfv)，所述第二vegf结合区为衍生自另一不同的抗vegf抗体的抗原结合片段(例如scfv)，且所述第三vegf结合区为衍生自vegfr的vegf结合片段。

11、在一些实施方案中，本发明的核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：

12、(1)scfv1；

13、(2)d2/3；

14、(3)d2/3-linker-scfv1；

15、(4)scfv1-linker-scfv2；

16、(5)scfv1-linker-d2/3；

17、(6)scfv1-linker-scfv2-linker-d2/3；

18、(7)scfv1-linker-d2/3-linker-scfv2；或

19、(8)d2/3-linker-scfv1-linker-scfv2，

20、其中，scfv1是编码衍生自抗vegf抗体的scfv的核苷酸序列，scfv2是编码衍生自另一不同的抗vegf抗体的scfv的核苷酸序列，d2/3是编码衍生自vegfr的vegf结合片段的核苷酸序列，所述vegf结合片段包含vegfr的d2/3，linker是编码接头的核苷酸序列，其中每个接头可以相同或不同。

21、在一些实施方案中，本发明的核酸构建体还可以包含编码抗体的fc区的核苷酸序列。

22、在一些实施方案中，所述fc区可以是选自以下抗体同种型的fc区：iga、igg、igm、igd和ige。在一些实施方案中，所述fc区可以是选自以下抗体亚型的fc区：igg1、igg2、igg3和igg4。在一个优选的实施方案中，所述fc区为人igg1的fc区。

23、在一些优选的实施方案中，本发明的核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：

24、(1)scfv1-linker-fc；

25、(2)d2/3-linker-fc；

26、(3)d2/3-linker-scfv1-fc；

27、(4)scfv1-linker-d2/3-fc；

28、(5)scfv1-linker-scfv2-fc；

29、(6)scfv1-linker-scfv2-linker-d2/3-fc；

30、(7)scfv1-linker-d2/3-linker-scfv2-fc；或

31、(8)d2/3-linker-scfv1-linker-scfv2-fc，

32、其中，scfv1是编码衍生自抗vegf抗体的scfv的核苷酸序列，scfv2是编码衍生自另一不同的抗vegf抗体的scfv的核苷酸序列，d2/3是编码衍生自vegfr的vegf结合片段的核苷酸序列，所述vegf结合片段包含vegfr的d2/3，linker是编码接头的核苷酸序列，其中每个接头可以相同或不同，fc是编码抗体fc区的核苷酸序列。

33、在本发明的核酸构建体的实施方案中，所述抗vegf抗体可以是任何特异性结合vegf的抗体。在一些优选的实施方案中，所述抗vegf抗体选自brolucizumab，ranibizumab或aflibercept。

34、在一些优选的实施方案中，本发明的核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：

35、(1)d2/3；

36、(2)d2/3-fc；

37、(3)brolscfv；

38、(4)brolscfv-fc；

39、(5)raniscfv；

40、(6)raniscfv-fc；

41、(7)d2/3-linker-raniscfv；

42、(8)raniscfv-linker-d2/3；

43、(9)brolscfv-linker-raniscfv-fc；

44、(10)brolscfv-linker-raniscfv；

45、(11)raniscfv-linker-brolscfv；

46、(12)raniscfv-linker-brolscfv-fc；

47、(13)d2/3-linker-raniscfv-fc；

48、(14)raniscfv-linker-d2/3-fc；

49、(15)d2/3-linker-brolscfv-linker-raniscfv-fc；

50、(16)d2/3-linker-brolscfv-linker-raniscfv；

51、(17)brolscfv-linker-d2/3-linker-raniscfv；

52、(18)brolscfv-linker-d2/3-linker-raniscfv-fc；

53、(19)raniscfv-linker-brolscfv-linker-d2/3；

54、(20)raniscfv-linker-brolscfv-linker-d2/3-fc；

55、(21)brolscfv-linker-d2/3；

56、(22)brolscfv-linker-d2/3-fc；

57、(23)d2/3-linker-brolscfv；或

58、(24)brolscfv-linker-d2/3，

59、其中，brolscfv为编码衍生自brolucizumab的scfv的核苷酸序列，raniscfv为编码衍生自ranibizumab的scfv的核苷酸序列，d2/3为编码衍生自vegfr的vegf结合片段的核苷酸序列，所述vegf结合片段包含vegfr的d2/3，linker是编码接头的核苷酸序列，其中每个接头可以相同或不同，fc是编码抗体fc区的核苷酸序列。

60、在一些实施方案中，本发明的核酸构建体还可以在5’端包含编码n端信号序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述n端信号序列具有seq id no:45所示的氨基酸序列。

61、相应地，在一些实施方案中，本发明的核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：

62、(1)signal-scfv1-linker-fc；

63、(2)signal-d2/3-linker-fc；

64、(3)signal-d2/3-linker-scfv1-fc；

65、(4)signal-scfv1-linker-d2/3-fc；

66、(5)signal-scfv1-linker-scfv2-fc；

67、(6)signal-scfv1-linker-scfv2-linker-d2/3-fc；

68、(7)signal-scfv1-linker-d2/3-linker-scfv2-fc；或

69、(8)signal-d2/3-linker-scfv1-linker-scfv2-fc，

70、其中，signal是编码5’端信号序列的核苷酸序列，scfv1是编码衍生自抗vegf抗体的scfv的核苷酸序列，scfv2是编码衍生自另一不同的抗vegf抗体的scfv的核苷酸序列，d2/3是编码衍生自vegfr的vegf结合片段的核苷酸序列，所述vegf结合片段包含vegfr的d2/3，linker是编码接头的核苷酸序列，其中每个接头可以相同或不同，fc是编码抗体fc区的核苷酸序列。

71、在一些优选的实施方案中，本发明的核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：

72、(1)signal-d2/3；

73、(2)signal-d2/3-fc；

74、(3)signal-brolscfv；

75、(4)signal-brolscfv-fc；

76、(5)signal-raniscfv；

77、(6)signal-raniscfv-fc；

78、(7)signal-d2/3-linker-raniscfv；

79、(8)signal-raniscfv-linker-d2/3；

80、(9)signal-brolscfv-linker-raniscfv-fc；

81、(10)signal-brolscfv-linker-raniscfv；

82、(11)signal-raniscfv-linker-brolscfv；

83、(12)signal-raniscfv-linker-brolscfv-fc；

84、(13)signal-d2/3-linker-raniscfv-fc；

85、(14)signal-raniscfv-linker-d2/3-fc；

86、(15)signal-d2/3-linker-brolscfv-linker-raniscfv-fc；

87、(16)signal-d2/3-linker-brolscfv-linker-raniscfv；

88、(17)signal-brolscfv-linker-d2/3-linker-raniscfv；

89、(18)signal-brolscfv-linker-d2/3-linker-raniscfv-fc；

90、(19)signal-raniscfv-linker-brolscfv-linker-d2/3；

91、(20)signal-raniscfv-linker-brolscfv-linker-d2/3-fc；

92、(21)signal-brolscfv-linker-d2/3；

93、(22)signal-brolscfv-linker-d2/3-fc；

94、(23)signal-d2/3-linker-brolscfv；或

95、(24)signal-brolscfv-linker-d2/3，

96、其中，signal是编码5’端信号序列的核苷酸序列，brolscfv为编码衍生自brolucizumab的scfv的核苷酸序列，raniscfv为编码衍生自ranibizumab的scfv的核苷酸序列，d2/3为编码所述衍生自vegfr的vegf结合片段的核苷酸序列，所述vegf结合片段包含vegfr的d2/3，linker是编码接头的核苷酸序列，其中每个接头可以相同或不同，fc是编码抗体fc区的核苷酸序列。

97、在一些实施方案中，衍生自brolucizumab的scfv包含如seq id no:1所示的氨基酸序列，或与seq id no:1具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的核酸构建体中的编码衍生自brolucizumab的scfv的核苷酸序列具有如seq id no:2所示的核苷酸序列，或与seq id no:2具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列。

98、在一些实施方案中，衍生自ranibizumab的scfv包含如seq id no:3所示的氨基酸序列，或与seq id no:3具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的核酸构建体中的编码衍生自ranibizumab的scfv的核苷酸序列包含如seq id no:4所示的核苷酸序列，或与seq id no:4具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列。

99、在一些实施方案中，衍生自vegfr的vegf结合片段包含如seq id no:5所示的氨基酸序列，或与seq id no:5具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的核酸构建体中的编码衍生自vegfr的vegf结合片段的核苷酸序列包含如seq id no:6所示的核苷酸序列，或与seq id no:6具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列。

100、在一些实施方案中，抗体fc区包含如seq id no:34所示的氨基酸序列或与seq idno:34具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，核酸构建体中包含的编码抗体fc区的核苷酸序列包含如seq id no:35所示的核苷酸序列或与seq id no:35具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。

101、在本发明的核酸构建体包含一个或多个接头的情况下，所述接头可以相同或者不同。在一些实施方案中，所述接头为可切割接头。在另一些实施方案中，所述接头为不可切割的接头。在一些实施方案中，所述接头为柔性接头。在另一些实施方案中，所述接头为刚性接头。

102、在一些优选的实施方案中，所述接头各自独立地选自(gs)n，(ggs)n，(gggs)n，(ggggs)n，(gly)8，(gly)6和(eaaak)n，其中n为1-10，优选n为2-8，更优选n为4或5。

103、在一些具体的实施方案中，本发明的表达载体从5’端至3’端包含以下结构：d2/3-linker-raniscfv，其中，raniscfv为编码衍生自ranibizumab的scfv的核苷酸序列，d2/3为编码衍生自vegfr的vegf结合片段的核苷酸序列，所述vegf结合片段包含vegfr的d2/3，linker是编码接头的核苷酸序列。

104、在一些实施方案中，本发明的表达载体编码融合蛋白，所述融合蛋白包含如seqid no:13所示的氨基酸序列或与seq id no:13具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的表达载体包含如seq id no:14所示的核苷酸序列或与seq id no:14具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。

105、在一些具体的实施方案中，本发明的核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：brolscfv-linker-raniscfv-fc，其中，brolscfv为编码衍生自brolucizumab的scfv的核苷酸序列，raniscfv为编码衍生自ranibizumab的scfv的核苷酸序列，linker是编码接头的核苷酸序列，fc是编码抗体fc区的核苷酸序列。

106、在一些实施方案中，本发明的表达载体编码融合蛋白，所述融合蛋白包含如seqid no:7所示的氨基酸序列或与seq id no:7具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的表达载体包含如seq id no:8所示的核苷酸序列或与seq id no:8具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。

107、在一些具体的实施方案中，本发明的表达载体从5’端至3’端包含以下结构：brolscfv-linker-raniscfv，其中，brolscfv为编码衍生自brolucizumab的scfv的核苷酸序列，raniscfv为编码衍生自ranibizumab的scfv的核苷酸序列，linker是编码接头的核苷酸序列。

108、在一些实施方案中，本发明的表达载体编码融合蛋白，所述融合蛋白包含如seqid no:9所示的氨基酸序列或与seq id no:9具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的表达载体包含如seq id no:10所示的核苷酸序列或与seq id no:10具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。

109、在一些具体的实施方案中，本发明的表达载体从5’端至3’端包含以下结构：d2/3-linker-raniscfv-fc，其中，raniscfv为编码衍生自ranibizumab的scfv的核苷酸序列，d2/3为编码所述衍生自vegfr的vegf结合片段的核苷酸序列，所述vegf结合片段包含vegfr的d2/3，linker是编码接头的核苷酸序列，fc是编码抗体fc区的核苷酸序列。

110、在一些实施方案中，本发明的表达载体编码融合蛋白，所述融合蛋白包含如seqid no:11所示的氨基酸序列或与seq id no:11具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的表达载体包含如seq id no:12所示的核苷酸序列或与seq id no:12具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。

111、在一些具体的实施方案中，本发明的表达载体从5’端至3’端包含以下结构：d2/3-linker-brolscfv-linker-raniscfv-fc，其中，brolscfv为编码衍生自brolucizumab的scfv的核苷酸序列，raniscfv为编码衍生自ranibizumab的scfv的核苷酸序列，d2/3为编码所述衍生自vegfr的vegf结合片段的核苷酸序列，所述vegf结合片段包含vegfr的d2/3，linker是编码接头的核苷酸序列，其中每个接头可以相同或不同，fc是编码抗体fc区的核苷酸序列。

112、在一些实施方案中，本发明的表达载体编码融合蛋白，所述融合蛋白包含如seqid no:15所示的氨基酸序列或与seq id no:15具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的表达载体包含如seq id no:16所示的核苷酸序列或与seq id no:16具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。

113、在一些具体的实施方案中，本发明的表达载体从5’端至3’端包含以下结构d2/3-linker-brolscfv-linker-raniscfv，其中，brolscfv为编码衍生自brolucizumab的scfv的核苷酸序列，raniscfv为编码衍生自ranibizumab的scfv的核苷酸序列，d2/3为编码所述衍生自vegfr的vegf结合片段的核苷酸序列，所述vegf结合片段包含vegfr的d2/3，linker是编码接头的核苷酸序列，其中每个接头可以相同或不同。

114、在一些实施方案中，本发明的表达载体编码融合蛋白，所述融合蛋白包含如seqid no:17所示的氨基酸序列或与seq id no:17具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的表达载体包含如seq id no:18所示的核苷酸序列或与seq id no:18具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。

115、在一些具体的实施方案中，本发明的表达载体从5’端至3’端包含以下结构：d2/3-linker-brolscfv，其中，brolscfv为编码衍生自brolucizumab的scfv的核苷酸序列，d2/3为编码所述衍生自vegfr的vegf结合片段的核苷酸序列，所述vegf结合片段包含vegfr的d2/3，linker是编码接头的核苷酸序列。

116、在一些实施方案中，本发明的表达载体编码融合蛋白，所述融合蛋白包含如seqid no:19所示的氨基酸序列或与seq id no:19具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的表达载体包含如seq id no:20所示的核苷酸序列或与seq id no:20具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。

117、在一些具体的实施方案中，本发明的表达载体从5’端至3’端包含以下结构：brolscfv-linker-d2/3，其中，brolscfv为编码衍生自brolucizumab的scfv的核苷酸序列，d2/3为编码所述衍生自vegfr的vegf结合片段的核苷酸序列，所述vegf结合片段包含vegfr的d2/3，linker是编码接头的核苷酸序列。

118、在一些实施方案中，本发明的表达载体编码融合蛋白，所述融合蛋白包含如seqid no:21所示的氨基酸序列或与seq id no:21具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的表达载体包含如seq id no:22所示的核苷酸序列或与seq id no:22具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。

119、在一些实施方案中，本发明的表达载体还包含启动子序列，用于所述核苷酸序列的表达。在一些实施方案中，所述启动子选自cbh、cmv、cagg、cag、rpe65和vmd2启动子。在优选的实施方案中，所述启动子为cagg。

120、在一些实施方案中，所述cbh启动子具有如seq id no:28所示的核苷酸序列。

121、在一些实施方案中，所述cmv启动子具有如seq id no:29所示的核苷酸序列。

122、在一些实施方案中，所述cagg启动子具有如seq id no:30所示的核苷酸序列。

123、在一些实施方案中，所述cag启动子具有如seq id no:31所示的核苷酸序列。

124、在一些实施方案中，所述rpe65启动子具有如seq id no:32所示的核苷酸序列。

125、在一些实施方案中，所述vmd2启动子具有如seq id no:33所示的核苷酸序列。

126、在一些实施方案中，本发明的表达载体为病毒载体。在一些实施方案中，本发明的表达载体为在宿主细胞中能够稳定表达的病毒载体。

127、在一些实施方案中，本发明的表达载体选自牛乳头瘤病毒载体、eb病毒载体、逆转录病毒载体(例如慢病毒载体)和腺相关病毒载体。

128、在一些实施方案中，本发明的表达载体为慢病毒表达载体。在一些优选的实施方案中，所述慢病毒载体还包含选自嵌合型ltr启动子、hiv-1包装信号(ψ)、中心聚嘌呤区(cppt)、rev应答元件(rre)、多嘌呤片段(ppt)、土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件(wpre)、sv40病毒的多腺苷酸化信号(sv40 pa signal)、sv40病毒的复制起始位点(sv40 ori)和自失活长末端重复序列中的一个或多个元件。

129、在另一些实施方案中，本发明的表达载体为腺相关病毒(aav)载体。在一些优选的实施方案中，所述腺相关病毒载体还包含选自sv40病毒的多腺苷酸化信号(sv40sl)和反向末端重复序列(itr)的一个或多个元件。

130、在第二方面，本发明提供一种病毒颗粒。本发明的病毒颗粒包含如本发明第一方面所述的表达载体。在一些优选的实施方案中，本发明的病毒颗粒是慢病毒颗粒或腺相关病毒颗粒。

131、在第三方面，本发明提供了一种细胞，所述细胞包含如本发明第一方面所述的表达载体。

132、在一些实施方案中，本发明的细胞包含本发明所述的腺相关病毒表达载体，并且还包含用于将所述腺相关病毒表达载体组装到病毒颗粒中的血清型质粒和/或辅助质粒。

133、在另一些实施方案中，本发明的细胞包含本发明所述的慢病毒表达载体，并且还包含用于将所述慢病毒表达载体组装到慢病毒颗粒中的包膜质粒和/或包装质粒。

134、在第四方面，本发明提供了一种细胞，其已经使用如本发明第二方面所述的病毒颗粒感染。在一些实施方案中，所述的细胞为视网膜细胞。在优选的实施方案中，所述的细胞为人视网膜色素上皮细胞。

135、在第五方面，本发明提供一种载体系统，其包含本发明所述的表达载体，和任选地一种或多种另外的载体例如质粒。在一些实施方案中，所述载体系统进一步包含宿主细胞，优选地所述宿主细胞是293t细胞。

136、在一些实施方案中，所述载体系统是慢病毒载体系统。在一些实施方案中，所述慢病毒载体系统包括慢病毒表达载体和辅助质粒。在一些实施方案中，所述辅助质粒包含编码gag和pol蛋白的一个或者多个核苷酸序列以及任选地编码其它病毒包装组件的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述辅助质粒可以包括包装质粒和/或包膜质粒。在一些实施方案中，所述慢病毒载体系统还包括宿主细胞，所述宿主细胞可以为生产慢病毒的细胞，例如可以为293t细胞。

137、在一些实施方案中，所述载体系统是腺相关病毒(aav)载体系统。在一些实施方案中，所述aav载体系统包括aav表达载体以及血清型质粒和/或辅助质粒。在一些实施方案中，所述辅助质粒包含编码病毒包装组件的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述血清型质粒选自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8和aav9血清型。在一些实施方案中，所述aav载体系统还包括宿主细胞，所述宿主细胞可以为生产腺相关病毒的细胞，例如可以为293t细胞。

138、在第六方面，本发明提供了一种组合物(例如药物组合物)，其包含如本发明第一方面所述的表达载体、如本发明第二方面所述的病毒颗粒、如本发明第三方面或第四方面所述的细胞、或如本发明第五方面所述的载体系统。任选地，本发明的组合物还包含药学上可接受的载剂和/或赋形剂。

139、在第七方面，本发明提供了一种用于眼内递送的系统，其包括：如本发明第一方面所述的表达载体、如本发明第二方面所述的病毒颗粒、如本发明第三方面或第四方面所述的细胞、如本发明第五方面所述的载体系统、或如本发明第六方面所述的组合物；和b)用于眼内递送的装置。

140、在一些实施方案中，所述用于眼内递送的装置选自用于玻璃体内递送的装置、用于视网膜下腔递送的装置和用于脉络膜上腔递送的装置。

141、在第八方面，本发明提供了一种用于受试者中治疗年龄相关性黄斑变性的方法，其包括向受试者的眼内施用如本发明第一方面所述的表达载体、如本发明第二方面所述的病毒颗粒、如本发明第三方面或第四方面所述的细胞、本发明第五方面所述的载体系统、或如本发明第六方面所述的组合物的步骤。在一些实施方案中，所述年龄相关性黄斑变性为湿性黄斑变性。

142、在一些优选的实施方案中，所述表达载体、病毒颗粒、细胞、载体系统或组合物被施用到所述受试者的玻璃体内和/或视网膜下腔和/或脉络膜上腔。