一株具有增强肠道屏障功能的益生台湾乳杆菌及其应用

本发明涉及一株具有增强肠道屏障功能的益生台湾乳杆菌及其应用，属于微生物技术以及医药。

背景技术：

1、肠道既是营养物质消化和吸收的重要器官，又是保持机体内环境稳定的先天性屏障。肠道黏液是保护肠道健康的第一道物理防线，防止抗原、毒素和细菌直接接触上皮细胞，同时对维持肠道内环境的动态平衡具有重要作用。肠道黏蛋白主要由杯状细胞合成、分泌，具有凝胶特性，其中，构成黏液层的骨架主要成分是黏蛋白2(mucin2，muc2)。紧密连接蛋白是维持肠道屏障的另一类重要蛋白。肠上皮细胞中，最常见的紧密连接蛋白包含以下四种，分别是闭合小环蛋白(zonula occludens，zos)、咬合蛋白(occludin)、闭合蛋白(claudins)及连接粘附分子(junctional adhesion molecule，jam)。肠道黏液和上皮紧密连接共同作用，建立了一个极其统一的黏膜屏障系统，共同限制腔内内容物接触肠上皮细胞。大量动物实验和临床研究发现肠道屏障的损伤会导致肠道通透性的增加，增加细菌抗原的移位，从而引发各种有害物质和病原体进入血液，造成多种代谢疾病的发生发展。常见的与肠道屏障功能失调相关的疾病有胃肠道疾病、乳糜泻、食物过敏以及一些肠外疾病如肥胖、骨质疏松、酒精性肝病和脂肪肝等。

2、台湾乳杆菌(lactobacillus taiwanensis)是一种革兰氏阳性菌，过氧化氢酶阴性，非运动性的兼性厌氧菌。台湾乳杆菌最早是从青贮饲料中分离鉴定获得的，与加氏乳杆菌和约氏乳杆菌是亲缘关系最密切的物种。台湾乳杆菌具有潜在的益生特性，给balb/c小鼠饮用含2×108cfu/ml台湾乳杆菌的水，能够显著上调小鼠肠道treg细胞的数量(公开于reynolds la,smith ka,filbey kj,harcus y,hewitson jp,redpath sa,valdez y,yebramj,finlay bb,maizelsrm.commensal-pathogen interactions in the intestinaltract:lactobacilli promote infection with,and are promoted by,helminthparasites.gut microbes.2014；5(4):522-32.)。现有技术披露了在急性肠炎小鼠模型中，台湾乳杆菌clg01的干预可以通过促进肠道免疫球蛋白a的分泌，下调炎症因子ii型干扰素(ifn-γ)的表达，来改善肠道免疫调节通路，从而维持肠道免疫稳态(公开于李筱瑜.台湾乳杆菌clg01的全基因组测序及益生特性研究[d].山东大学2021.)。除改善肠道免疫失调外，肠道黏液层、肠道机械屏障等对于维持肠道屏障完整性也发挥着至关重要的作用，目前尚无可以改善肠道黏液层、肠道机械屏障的台湾乳杆菌。

技术实现思路

1、[技术问题]

2、本发明要解决的技术问题是现有技术中缺乏能够增强肠道屏障的台湾乳杆菌。

3、[技术方案]

4、为了解决上述技术问题，本发明旨在提供一株具有增强肠道屏障的益生台湾乳杆菌(lactobacillus taiwanensis，l.taiwanensis)ccfm1318，该菌株在体外肠道耐受能力良好，黏附肠上皮细胞能力较强，在肠道内的定植性较强。且能够显著上调dss刺激后caco-2细胞中claudin-1、claudin-3、occludin和zo-1紧密连接蛋白相关基因的表达水平，保护肠屏障功能。该菌株的上清液能够改善衣霉素造成的内质网应激，上调稳态下ls174t细胞黏蛋白muc2的表达。

5、本发明提供了一株台湾乳杆菌(lactobacillus taiwanensis)ccfm1318，所述台湾乳杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：gdmcc no.63714，保藏日期为2023年8月4日。

6、所述台湾乳杆菌ccfm1318来源于健康人群粪便样本，该菌株经测序分析，其16srdna序列如seq id no.1所示，将测序得到的序列在ncbi的blast中进行核酸序列比对，结果显示菌株为台湾乳杆菌，命名为台湾乳杆菌ccfm1318。

7、所述台湾乳杆菌(lactobacillus taiwanensis)ccfm1318具有下述生物学特性：

8、(a)生长特性：在mrs固体培养基上的菌落呈半透明、边缘不规则的菌落。

9、(b)体外胃肠道耐受能力良好，黏附肠上皮细胞能力较强，在胃肠道内的定植性较强。

10、(c)显著上调dss刺激后caco-2细胞中claudin-1、claudin-3、occludin和zo-1紧密连接蛋白相关基因的表达水平，保护肠屏障功能。

11、(d)细菌上清液能够改善衣霉素造成的内质网应激，上调稳态下ls174t细胞黏蛋白muc2的表达。

12、本发明还提供了一种含有上述台湾乳杆菌(lactobacillus taiwanensis)ccfm1318或其发酵液的微生物制剂。

13、本发明的一种实施方式中，所述微生物制剂中含有上述台湾乳杆菌(lactobacillus taiwanensis)ccfm1318或其冻干粉。

14、本发明的一种实施方式中，所述微生物制剂中，台湾乳杆菌的活菌数为不低于108cfu/ml或108cfu/g。

15、本发明还提供了一种含有上述台湾乳杆菌(lactobacillus taiwanensis)ccfm1318或上述微生物制剂的产品，所述产品包括食品、药品或保健品。

16、本发明的一种实施方式中，所述产品中，台湾乳杆菌的活菌数为不低于108cfu/ml或108cfu/g。

17、本发明的一种实施方式中，所述食品包括发酵食品或保健食品。

18、本发明的一种实施方式中，所述发酵食品包括固态食品、液态食品、半固态食品。

19、本发明的一种实施方式中，所述食品为使用含有上述台湾乳杆菌(lactobacillustaiwanensis)ccfm1318的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品或果蔬制品，或所述食品为含有上述台湾乳杆菌(lactobacillus taiwanensis)ccfm1318的饮料或零食。

20、本发明的一种实施方式中，所述发酵剂的制备方法为：

21、(1)将台湾乳杆菌(lactobacillus taiwanensis)ccfm1318培养，收集菌体；

22、(2)冻干步骤(1)所述菌体，得到发酵剂。

23、在本发明的一种实施方式中，所述冻干中添加了冻干保护剂，所述冻干保护剂包含了(100-160)g/l的脱脂奶粉，优选为130g/l。

24、本发明的一种实施方式中，所述冻干保护剂为保护剂和菌体的质量比为(1-4):1，优选为2：1。

25、本发明的一种实施方式中，所述培养基为：占培养基总质量(1-5)％的蛋白胨、占培养基总质量(0.5-2)％的酵母浸粉、占培养基总质量(1-4)％的葡萄糖，余量以水补齐，优选的，所述培养基为：占培养基总质量2％的蛋白胨、占培养基总质量1％的酵母浸粉、占培养基总质量2％的葡萄糖，余量以水补齐。

26、本发明的一种实施方式中，所述药品为含有上述台湾乳杆菌(lactobacillustaiwanensis)ccfm1318的药物载体和/或药用辅料。

27、本发明的一种实施方式中，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒、脂质体中的一种或多种。

28、本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含赋形剂和/或附加剂。

29、本发明的一种实施方式中，赋形剂包含黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂中的一种或多种。

30、本发明的一种实施方式中，所述附加剂包含增溶剂、助溶剂、潜溶剂、防腐剂中的一种或多种。

31、本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型包括粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。

32、本发明还提供上述台湾乳杆菌(lactobacillus taiwanensis)ccfm1318或上述微生物制剂或上述产品在不以疾病的诊断和治疗为目的的增强和/或保护肠道屏障中的应用。

33、本发明的一种实施方式中，所述增强和保护肠道屏障包括以下至少一方面的功能：

34、(a)上调claudin-1、claudin-3、occludin和/或zo-1紧密连接蛋白基因的表达水平；

35、(b)上调黏蛋白muc2的表达。

36、有益效果：

37、本发明筛选出了一株体外益生特性良好的台湾乳杆菌ccfm1318，其具有增强肠道屏障的益生作用，具体体现在：

38、1、台湾乳杆菌ccfm1318细菌上清液能够上调稳态下ls174t细胞黏蛋白muc2的表达。台湾乳杆菌ccfm1318组的muc2的表达量是正常对照组的1.40倍，空白培养基对照组、约氏乳杆菌fgsyc6ms组和约氏乳杆菌fahbz615组的与正常对照组相比，muc2的表达量不具有显著性差异。

39、2、台湾乳杆菌ccfm1318的体外胃肠道耐受能力良好，在模拟胃液中3h存活率为96.28％，模拟肠液中4h存活率为44.12％；黏附肠上皮细胞能力较强，对ht-29细胞黏附率为8.95％；

40、3、台湾乳杆菌ccfm1318能够显著上调dss刺激后caco-2细胞中claudin-1、claudin-3、occludin和zo-1紧密连接蛋白相关基因的表达水平：台湾乳杆菌ccfm1318组的claudin-1、claudin-3、occludin和zo-1的mrna相对表达量相较于造模组分别上调了1.91倍、2.76倍、2.64倍和2.28倍。

41、生物材料保藏

42、一株台湾乳杆菌(lactobacillus taiwanensis)ccfm1318，分类学命名为lactobacillus taiwanensis，已于2023年08月04日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno：63714，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所。