一种高效合成2′-岩藻糖基乳糖的基因工程菌的构建及其应用

本发明涉及一种高效合成2′-岩藻糖基乳糖的基因工程菌的构建及其应用，属于微生物基因工程和生物合成领域。

背景技术：

1、母乳低聚糖(hmos)作为母乳中的第三大固体成分及第一大活性成分，对于婴儿的健康发育不可或缺。其中，2′-岩藻糖基乳糖(2'-fucoselactose，2′-fl)含量最高，约占低聚糖总量的31％。它的健康益处已被广泛研究，包括作为益生元、促进免疫系统发育、维持肠道稳态、助力大脑发育和增强认知作用。2′-fl是首批商业化hmo之一，已被批准在各个国家和地区销售。因此，2′-fl的市场需求很大，尤其是作为婴儿配方奶粉的添加剂。随着先进技术的发展，人们采取了各种方法来有效地合成2′-fl。

2、综合运用各种代谢工程策略的微生物合成法是目前大规模生产2′-fl的主流方法，许多微生物宿主，尤其是大肠杆菌bl21(de3)和bl21star(de3)被广泛报道用于高效生产2′-fl，相比之下，大肠杆菌mg1655的改造与应用较少。近日sun等人通过敲除竞争旁路且整合途径酶，调节外排蛋白seta和果糖-1，6-二磷酸酶glpx的表达强度，同时对mg1655菌株进行适应性进化等策略，最终构建含双质粒的菌株在补料分批发酵中产量达到61.06g/l，生产速率为目前最高的1.70g/l/h。然而，基于过表达质粒上所携带基因的生产策略可能会在放大发酵过程中存在遗传不稳定性，同时，添加抗生素对于下游纯化和产品安全所带来的问题和风险难以把控。因此，当前的研究也更倾向于利用无需添加抗生素和诱导剂的全基因组型微生物菌种生产2′-fl。lin等人将四个幽门螺杆菌来源的α-1,2-岩藻糖基转移酶基因(futc)表达框整合到宿主mg1655基因组中并破坏竞争途径，在3-l发酵罐中最终生产10.3g/l的2′-fl。目前，质粒型及全基因组型的大肠杆菌mg1655产2′-fl细胞工厂都有待进一步升级改造。

3、2′-fl的产量通常取决于gdp-岩藻糖和乳糖的供应以及高活性α-1,2-岩藻糖基转移酶的应用。一般来说，gdp-岩藻糖的供应可以通过加强从头合成gdp-岩藻糖途径来增加，该途径由磷酸甘露糖-6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶、gdp-甘露糖-4,6-脱氢酶和gdp岩藻糖合酶组成。此外，α-1,2-岩藻糖基转移酶是2′-fl生物合成的另一个关键限速因子，其关键在于酶活性、表达水平和产物特异性。产物特异问题主要在于一些常用于合成2'-fl的ɑ-1,2-岩藻糖基转移酶，如幽门螺杆菌属来源的fuct2和大肠杆菌o126来源的wbgl，在催化过程中同时会伴随副产物二岩藻糖四糖dfl和3-岩藻糖基乳糖的合成，增加了下游分离纯化的成本。

技术实现思路

1、一方面，无论是质粒型还是全基因组型重组大肠杆菌mg1655的产能都有待进一步提升，另一方面，一些α-1,2-岩藻糖基转移酶在催化过程中会产生副产物二岩藻糖四糖dfl，增加下游分离纯化的成本。针对现存问题，一方面，本发明提供构建生物制剂的方法，包括两种基因工程菌大肠杆菌mg1655。本发明通过敲除竞争旁路、强化关键酶的启动子及利用游离质粒过表达通路酶和α-1,2-岩藻糖基转移酶等策略提升质粒型工程菌的产能；通过敲除竞争旁路、强化关键酶的启动子及整合α-1,2-岩藻糖基转移酶表达框等策略提升全基因组型工程菌的产能；通过选择具有高催化活性和严格底物特异性的α-1,2-岩藻糖基转移酶bkht来解决副产物生成问题。

2、本发明提供的一种高效合成2′-fl的质粒型重组大肠杆菌mg1655的构建方法如下：

3、所述重组大肠杆菌在底盘细胞中敲除了β-半乳糖苷酶基因lacz和udp-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaj，利用强组成型启动子pj23119替换基因组上β-半乳糖苷透性酶lacy基因、manc-manb、gmd-fcl基因簇的原始启动子中的一种或多种。所述基因工程菌游离表达了磷酸甘露糖酶基因、甘露糖1-鸟苷酸转移酶基因、gdp-d-甘露糖-4,6-脱水酶基因、gdp-岩藻糖合成酶基因和α-1,2-岩藻糖基转移酶基因。

4、本发明提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌为，敲除了底盘细胞e.colimg1655基因组上的β-半乳糖苷酶基因lacz和udp-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaj，并强化表达了磷酸甘露糖变位酶-甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因簇manc-manb、gdp-甘露糖-6-脱氢酶-gdp-岩藻糖合成酶基因簇gmd-fcl、乳糖通透酶lacy、来源于幽门螺杆菌属helicobacter sp.13s00401-1的α-1,2-岩藻糖基转移酶bkht。

5、本发明提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌为，敲除了底盘细胞e.colimg1655基因组上的β-半乳糖苷酶基因lacz和udp-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaj，并采用pj23119启动子分别替换e.coli mg1655基因组上的乳糖通透酶lacy、manc-manb基因簇、gmd-fcl基因簇原始的启动子，同时游离表达了基因簇manc-manb、基因簇gmd-fcl、来源于幽门螺杆菌属helicobacter sp.13s00401-1的α-1,2-岩藻糖基转移酶bkht。

6、在本发明的一种实施方式中，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶bkht来源于幽门螺杆菌属helicobacter sp.13s00401-1，核苷酸序列如seq id no.1所示。

7、在本发明的一种实施方式中，采用ptrc99a载体游离表达α-1,2-岩藻糖基转移酶bkht；采用pcdfduet-1载体游离表达了基因簇manc-manb、基因簇gmd-fcl。

8、在本发明的一种实施方式中，将采用核苷酸序列如seq id no.4所示的tac启动子替换载体上的原始trc启动子，过表达α-1,2-岩藻糖基转移酶bkht；采用核苷酸序列如seqid no.4所示的tac启动子过表达manc-manb基因簇，采用核苷酸序列如seq id no.4所示的pj23119启动子过表达gmd-fcl基因簇。

9、在本发明的一种实施方式中，所述β-半乳糖苷酶编码基因lacz的genbank号为np_414878.1，编码udp-葡萄糖脂质载体转移酶编码基因wcaj的genbank号为np_416551.1。

10、在本发明的一种实施方式中，所述磷酸甘露糖酶编码基因manb的genbank号为np_416552.1；所述甘露糖1-鸟苷酸转移酶编码基因manc的genbank号为np_416553.1；所述gdp-d-甘露糖-4,6-脱水酶编码基因gmd的genbank号为np_416557.1；所述gdp-岩藻糖合成酶编码基因fcl的genbank号为np_416556.1。

11、在本发明的一种实施方式中，所述bkht基因的genbank号为paf50342.1。

12、在本发明的一种实施方式中，所述reca基因的genbank号为act44368.1。

13、在本发明的一种实施方式中，所述arsb基因的genbank号为cad5999887.1。

14、在本发明的一种实施方式中，采用核苷酸序列如seq id no.5所示的pj23119启动子过表达了α-1,2-岩藻糖基转移酶bkht。

15、在本发明的一种实施方式中，α-1,2-岩藻糖基转移酶bkht的核苷酸序列如seq idno.1所示，基因簇manc-manb的核苷酸序列如seq id no.2所示，gmd-fcl基因簇核苷酸序列如seq id no.3所示。

16、本发明提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌为，敲除了底盘细胞e.colimg1655基因组上的β-半乳糖苷酶基因lacz和udp-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaj，并采用核苷酸序列如seq id no.5所示的pj23119启动子分别替换e.coli mg1655基因组上的乳糖通透酶lacy、manc-manb基因簇、gmd-fcl基因簇原始的启动子，在arsb位点和/或reca位点整合α-1,2-岩藻糖基转移酶bkht。

17、在本发明的一种实施方式中，所述磷酸甘露糖酶编码基因manb的genbank号为np_416552.1；所述甘露糖1-鸟苷酸转移酶编码基因manc的genbank号为np_416553.1；所述gdp-d-甘露糖-4,6-脱水酶编码基因gmd的genbank号为np_416557.1；所述gdp-岩藻糖合成酶编码基因fcl的genbank号为np_416556.1。

18、在本发明的一种实施方式中，所述bkht基因的genbank号为paf50342.1。

19、在本发明的一种实施方式中，所述reca基因的genbank号为act44368.1。

20、在本发明的一种实施方式中，所述arsb基因的genbank号为cad5999887.1。

21、在本发明的一种实施方式中，采用核苷酸序列如seq id no.5所示的pj23119启动子过表达了α-1,2-岩藻糖基转移酶bkht。

22、在本发明的一种实施方式中，α-1,2-岩藻糖基转移酶bkht的核苷酸序列如seq idno.1所示，基因簇manc-manb的核苷酸序列如seq id no.2所示，gmd-fcl基因簇核苷酸序列如seq id no.3所示。

23、本发明提供了一种提高大肠杆菌生产2′-岩藻糖基乳糖的方法，所述方法为，敲除了底盘细胞e.coli mg1655基因组上的β-半乳糖苷酶基因lacz和udp-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaj，并采用pj23119启动子分别替换e.coli mg1655基因组上的乳糖通透酶lacy、manc-manb基因簇、gmd-fcl基因簇原始的启动子，同时游离表达了基因簇manc-manb、基因簇gmd-fcl、α-1,2-岩藻糖基转移酶bkht；

24、在本发明的一种实施方式中，采用ptrc99a载体游离表达α-1,2-岩藻糖基转移酶bkht；采用pcdfduet-1载体游离表达了基因簇manc-manb、基因簇gmd-fcl。

25、在本发明的一种实施方式中，将采用核苷酸序列如seq id no.4所示的tac启动子替换原始trc启动子，过表达α-1,2-岩藻糖基转移酶bkht；采用核苷酸序列如seq id no.4所示的tac启动子过表达manc-manb基因簇，采用核苷酸序列如seq id no.5所示的pj23119启动子过表达gmd-fcl基因簇。

26、本发明提供了一种提高大肠杆菌生产2′-岩藻糖基乳糖的方法，所述方法为，敲除了底盘细胞e.coli mg1655基因组上的β-半乳糖苷酶基因lacz和udp-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaj，并采用pj23119启动子分别替换e.coli mg1655基因组上的乳糖通透酶lacy、manc-manb基因簇、gmd-fcl基因簇原始的启动子，同时游离表达了基因簇manc-manb、基因簇gmd-fcl、α-1,2-岩藻糖基转移酶bkht；

27、或所述方法为，敲除了底盘细胞e.coli mg1655基因组上的β-半乳糖苷酶基因lacz和udp-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaj，并采用核苷酸序列如seq id no.5所示的pj23119启动子分别替换e.coli mg1655基因组上的乳糖通透酶lacy、manc-manb基因簇、gmd-fcl基因簇原始的启动子，在arsb位点和/或reca位点整合α-1,2-岩藻糖基转移酶bkht。

28、在本发明的一种实施方式中，所述reca基因的genbank号为act44368.1。

29、在本发明的一种实施方式中，所述arsb基因的genbank号为cad5999887.1。

30、在本发明的一种实施方式中，采用核苷酸序列如seq id no.5所示的pj23119启动子过表达了α-1,2-岩藻糖基转移酶bkht。

31、在本发明的一种实施方式中，α-1,2-岩藻糖基转移酶bkht的核苷酸序列如seq idno.1所示，基因簇manc-manb的核苷酸序列如seq id no.2所示，gmd-fcl基因簇核苷酸序列如seq id no.3所示。

32、本发明还提供了一种制备2′-岩藻糖基乳糖的方法，所述方法为，以甘油为碳源，以乳糖为底物，以上述任一所述的重组大肠杆菌发酵生产2′-岩藻糖基乳糖。

33、在本发明的一种实施方式中，以所述的两种重组大肠杆菌mg1655为发酵菌株，在以甘油为碳源，乳糖为底物的发酵体系中生产2′-fl。

34、在本发明的一种实施方式中，在摇瓶或/和5-l发酵罐中发酵生产2′-fl。

35、在本发明的一种实施方式中，将所述重组大肠杆菌的种子液添加至含有20g/l甘油，5g/l酵母提取物的培养基中，37℃，200rpm，培养至od600＝0.7±0.1，加入终浓度为0.1～0.5mm iptg，同时加入终浓度为5～10g/l乳糖，25～28℃，180～220rpm继续诱导培养不少于72h。

36、在本发明的一种实施方式中，将所述重组大肠杆菌的种子液接种到发酵罐体系中，发酵体系的发酵温度37℃，搅拌转速200～800r/min，通气量1～5vvm，ph 6.6～6.8，发酵至od600＝15±1，加入终浓度为5～10g/l乳糖和终浓度为0.1～0.5mm的iptg(全基因组型菌株无需添加)，在25～28℃下诱导培养不少于100h。

37、在本发明的一种实施方式中，发酵体系中还含有30g/l甘油、5g/l酵母提取物、13.5g/l磷酸二氢钾、4.0g/l磷酸氢二氨、1.7g/l柠檬酸、1.4g/l七水硫酸镁和10ml/l微量金属元素；微量金属元素母液包括：10g/l硫酸亚铁，2.25g/l七水硫酸锌，1.0g/l无水硫酸铜，0.35g/l一水硫酸锰，0.23g/l十水硼酸钠，0.11g/l钼酸铵，2.0g/l二水氯化钙；甘油补加体系为：600g/l甘油、20g/l的七水硫酸镁、0.2g/l的硫胺素；乳糖补加体系为：200g/l乳糖。

38、本发明还提供了上述任一所述的重组大肠杆菌或上述方法在制备2′-岩藻糖基乳糖或含有2′-岩藻糖基乳糖产品中的应用。

39、在本发明的一种实施方式中，所述产品为食品、保健品。

40、有益效果

41、本发明在大肠杆菌mg1655里搭建了一条高效合理的从头合成2'-岩藻糖基乳糖通路，通过组合代谢工程策略设计改造所得的质粒型重组大肠杆菌mg1655摇瓶发酵2'-fl产量达到9.21g/l，5-l发酵罐补料分批发酵2'-fl的产量进一步达到了76.9g/l。而所述的无需添加抗生素和诱导剂的全基因组型重组大肠杆菌mg1655摇瓶发酵2'-fl产量达到7.41g/l，5-l发酵罐补料分批发酵2'-fl的产量进一步达到了50.1g/l，无论是质粒型还是全基因组型的产量均是用mg1655生产2'-岩藻糖基乳糖目前报道的最高值，两者均无副产物双岩藻糖基乳糖dfl的生成，显著降低了下游分离纯化的成本，且本发明所用的生产菌来源及α-1,2-岩藻糖基转移酶供体来源均符合目前卫健委对2'-岩藻糖基乳糖的公开征求意见稿中的要求，具有一定的放大生产潜力、商业应用价值和良好的产业化前景。