一种新型酰基转移酶酶制剂及其在手性醇/胺拆分中的应用

本发明涉及生物信息学、生物技术和绿色化工领域，尤其是涉及一种可在水溶液中高效催化转酯反应的新型酰基转移酶酶制剂及其在手性醇、手性胺等手性化合物拆分中的应用。

背景技术：

1、反应介质是生物催化有机合成工艺中的关键工艺参数，直接影响并决定了酶蛋白的构象、底物选择性、催化特定化学反应的动力学选择性、底物在反应体系中的溶解度、催化化学反应的速率、酶蛋白在反应介质中的稳定性和重复使用批次等。在生物催化有机合成工艺中，常用的反应介质有：有机溶剂、离子液、共晶溶剂和超临界二氧化碳等。按照绿色化学指导原则，生物催化有机合成工艺中，一种理想的反应介质应具备下列特点：无毒无害，或低毒低害(易分解或降解)，对环境友好；价廉易得；不易燃烧爆炸，不具有腐蚀性；沸点合适；生物相容性好；符合环境法规和fda相关法规等。

2、按照上述绿色化学指导原则，水是一种理想的反应介质。利用水作为生物催化工艺的反应介质，还具有下列优点：(1)不会破坏酶蛋白分子表面的水化层，有助于保持酶蛋白的稳定性；(2)简化后续合成产物的分离(如合成产物为疏水性的酯类物质，可与反应介质自动实现相分离)；(3)水-酶-底物之间形成的氢键网络，有助于稳定酶-底物过渡态复合物，提高酶催化化学反应的速率。

3、虽然水是一种理想的反应介质，但α/β折叠水解酶家族蛋白(α/βhydrolase-foldproteins)在催化转酯化反应的工艺中，很少利用水作为反应介质。在实际生产过程中，酶蛋白对反应体系中的水活度(或水含量)有严格的限制，仅能在无水或微水(维持蛋白质水化层及正确构象所需的水份，是结合水，不参与催化反应)反应体系中催化转酯化反应。

4、基于已解析的α/β折叠水解酶催化转酯化反应的分子机制(图1)，反应体系中若水过量，水分子将同苯乙醇竞争酰基-酶过渡态中间复合物，并释放出游离脂肪酸。此时，酶蛋白的催化活性表现为催化水解反应(副反应)；同时，产物乙酸苯乙酯也将被水解(图1)。因此，在水过量的酶促转酯化反应体系中，酶促反应的动力学选择性是倾向于转酯化反应还是水解反应，取决于酶蛋白转酯化比率的高低。转酯化比率是酶蛋白催化转酯化反应与催化水解反应初始速率之比。

5、转酯化比率低的α/β折叠水解酶蛋白催化转酯化反应时，反应体系中过量的水分将导致动力学选择性倾向于水解反应(副反应)；同时产生的脂肪酸(图1中为乙酸)将降低反应体系的ph值，并导致酶蛋白失活。为了抑制副反应，常常需要提高反应体系中酰基受体(图1中为苯乙醇)的摩尔浓度。已发现的大多数α/β折叠水解酶家族蛋白的转酯化比率均较低，在水溶液反应体系中，仅表现为水解活性，不能催化转酯化反应；只能在无水或微水反应体系中，才能催化转酯化反应。如大家熟知的candida antarctica脂肪酶b(calb)催化转酯化反应时，对反应体系中的水活度(water activity,aw)有严格的限制。为了降低转酯化反应体系中存在(产生)的水对反应平衡产生的消极影响，反应体系中还常常添加一定量的分子筛控水。即使是催化转酯化反应时具有较好水耐受性的脂肪酶(如c.antarctica脂肪酶a,cala)，反应体系中的水含量也需控制在低于15％(w/w)的范围内。

6、近年来，陆续发现包括mycobacterium smegmatis酰基转移酶(acyltransferase,msact)在内的10种α/β折叠水解酶家族蛋白可在水溶液中催化转酯化反应(表1)。其中，对三种(类)酶蛋白的研究较为活跃，分别是：(1)以msact为代表的酶蛋白，在应用领域得到最为广泛的使用；(2)以德国bornscheuer ut教授课题组为代表的对源自宏基因组中的est8/estce1及其同源蛋白的深入研究；(3)以法国dubreucq e教授课题组为代表的对源自candida sp.的cplip2及其同源蛋白的深入研究。目前，此类酶蛋白尚未得到我国学者的广泛关注和深入研究，仅检索到中国科学院咸漠研究员和本课题组的相关报导。

7、表1：水溶液中可催化转酯化(或酯化)反应的α/β折叠水解酶蛋白资源

8、

9、

10、从已有报导来看，上述能在水溶液中催化转酯化反应的各种野生型酶蛋白，其转酯化比率还有待提高。尤其是当反应体系中酰基受体(图1例中的苯乙醇)浓度较低时，其催化转酯化反应过程中，副反应仍较严重，酯化物的得率还较低。另外，已发现的上述酶蛋白，其活性中心可接受的底物范围还较窄，对极性化合物(如氨基酸、硫醇、辅酶a等，酶促反应中将作为酰基受体)的亲和力较弱，使其工业化应用还存在诸多制约。因此，利用生物信息学技术或蛋白质工程技术，挖掘并开发新型酶蛋白，丰富此类酶蛋白资源，具有重要的意义。

11、酶蛋白祖先序列重建(ancestral sequence reconstruction)技术是利用生物信息学技术手段，对某一多肽链氨基酸序列已知的现代酶蛋白，构建其系统发育树；在此基础上推导出该现代酶蛋白的远缘祖先蛋白(extant protein)及其进化过程中形成的一系列进化中间体蛋白(evolutionary intermediate)的多肽链氨基酸序列。酶蛋白祖先序列重建技术已成为挖掘酶蛋白资源、开发新型催化活性酶蛋白的重要途径之一，并有许多成功的报道。但尚未有利用该技术挖掘可在水溶液中催化转酯化反应的酶蛋白资源。申请人利用3d结构已解析的m.smegmatis酰基转移酶(msact,pdb数据库登录文件：2q0q)的多肽链氨基酸序列构建其系统进化树，并推导出系列msact的祖先蛋白及进化中间体蛋白序列序列，经功能验证，成功获得一个可在水溶液中高效催化转酯化反应的act-n7蛋白质。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种新型酰基转移酶酶制剂及其在手性醇/胺拆分中的应用。

2、本发明的目的是通过如下技术方案来实现的：

3、一种可在水溶液中高效催化转酯化反应的酰基转移酶act-n7，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

4、一种编码权利要求1所述的酰基转移酶act-n7的基因，其核苷酸序列如seq idno.2所示。

5、一种重组载体，其包含编码酰基转移酶act-n7的基因。

6、一种重组菌，其包含上述的重组载体。

7、一种固定化细胞，其包含上述的重组菌。

8、进一步的，上述固定化细胞的制备步骤如下：

9、1)将酰基转移酶act-n7的编码基因连接至表达载体pet28a，转化e.coli bl21(de3)，得到重组菌株e.coli bl21(de3)-pet28a/act-n7；

10、2)将重组菌株e.coli bl21(de3)-pet28a/act-n7在lb液体培养基中发酵培养，获得发酵液，离心收集菌体并重悬，得到菌悬液；

11、3)将菌悬液与氨基化修饰硅藻土混匀，加入戊二醛进行交联；

12、4)交联结束后，离心收集沉淀并用na2hpo4-nah2po4缓冲液和丙酮洗涤，室温干燥至恒重，得到含酰基转移酶act-n7的固定化细胞。

13、一种酰基转移酶酶制剂，其包含上述的固定化细胞。

14、上述的酰基转移酶act-n7或酰基转移酶酶制剂在手性醇和/或手性胺拆分中的应用。

15、进一步的，上述手性醇包括1-苯乙醇、6-甲基-5-庚烯基-2-醇、2-辛醇，上述手性胺包括α-甲基苄胺、1-(4-甲基苯基)乙胺、2-庚胺。

16、上述一种酰基转移酶act-n7在水解反应、过水解反应、转酯化反应中的应用。

17、本发明的显著优点在于：

18、1)新型酰基转移酶act-n7，在水溶液中催化转酯化反应时，对转酯化反应表现出更高的选择性。其kcat/km[转酯活性]/kcat/km[水解活性]的比值较msact蛋白而言，提高了8.5倍。

19、2)新型酰基转移酶act-n7在水溶液中，对多种手性醇和手性胺表现出一定的对映体拆分活性。该催化活性，在已发现的具有类似性质(可在水溶液中催化转酯反应)的酶蛋白无报道。

20、3)利用本工艺制备的全细胞催化剂，具有制备工艺简单、价格低廉、催化效果优良等优点。