一种捕获不同片段大小的cfDNA的方法与流程

本发明涉及生物医药，具体涉及一种捕获不同片段大小的cfdna的方法。

背景技术：

1、细胞外游离dna(cell-freedna，cfdna)是近年来液体活检领域的热点研究对象之一。cfdna主要指细胞通过各种机制释放到循环中的dna，在细胞凋亡坏死或更新期间，dna片段的脱落较多，贡献了cfdna最主要的片段来源(han,d.s.c.and y.m.d.lo,the nexusof cfdna and nuclease biology.trends genet,2021.37(8):p.758-770.)。由于cfdna携带有细胞基因组中的信息，这使得cfdna成为一种新型的监测技术，可以在无创的前提下获取胞内基因组的变化情况，为疾病的研究提供更便捷全面的基因组信息。cfdna产生于几乎所有细胞类型，但对肿瘤细胞而言，它们的产生量要比正常细胞高出数倍。

2、近年来，多种新型潜在的cfdna变异特征被不断发现，如染色质开放性(chromatinaccessibility)特征。最近的一些针对临床肿瘤样本的染色质开放性研究表明，肿瘤的发生伴随着异常染色质开放状态的改变(corces,m.r.,et al.,the chromatinaccessibility landscape of primary human cancers.science,2018.362(6413).)(pereira,r.m.,etal.,transcriptional and epigenetic regulation of t cellhyporesponsiveness.j leukoc biol,2017.102(3):p.601-615.)(scott-browne,j.p.,etal.,dynamic changes in chromatin accessibility occur in cd8(+)t cellsresponding to viral infection.immunity,2016.45(6):p.1327-1340.)。例如，针对皮肤t细胞淋巴瘤的研究发现，淋巴瘤的发生与异常的染色质开放性改变密切相关，该研究还揭示了肿瘤治疗干预的表观遗传学意义(qu,k.,et al.,chromatin accessibilitylandscape of cutaneous t cell lymphoma and dynamic response to hdacinhibitors.cancer cell,2017.32(1):p.27-41.e4.)。此外，研究人员使用atac-seq测序技术检测了多种肿瘤类型的全基因组染色质开放性，发现染色质开放性的异常改变与肿瘤的产生与发展具有较强相关性(corces,m.r.,et al.,the chromatin accessibilitylandscape of primary human cancers.science,2018.362(6413).)。因此，对染色质开放性的探究有助于深入对复杂疾病产生机制的理解。此外，最近的一些研究发现，cfdna在转录起始区域的覆盖度可以反映细胞内染色质的开放模式，可以鉴别是否存在肿瘤的产生，并且可以预示肿瘤的类型，这预示着cfdna开放性特征的检测有望为癌症发生及发展过程表观基因组变化提供新的知识及见解(sun,k.,et al.,orientation-aware plasma cell-free dna fragmentation analysis in open chromatin regions informs tissue oforigin.genome res,2019.29(3):p.418-427.)。

3、目前，现有技术无法实现对不同片段大小的cfdna的全面捕获，导致获得的表观遗传信息较少。

4、因此，亟需开发一种可以捕获不同片段大小的cfdna的方法。

技术实现思路

1、含有核小体的cfdna往往代表着非开放染色质区域，而不含有核小体的cfdna则可能代表着开放染色质区域，本发明聚焦于开发获得一个可以对血浆中不同片段大小的游离dna染色质开放性信号进行直接捕获的测序方法。

2、本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

3、为此，本发明第一方面提供一种捕获不同片段大小的cfdna的方法，所述方法包括：

4、(a)将体液样本进行交联固定，获得固定后的体液样本，将所述固定后的体液样本分为至少两份；

5、(b)取其中任意一份所述固定后的体液样本为样本一，解交联后，获得游离的不含核小体的cfdna和/或相邻核小体保护的长度不小于400bp的cfdna；

6、(c)取另外任意一份所述固定后的体液样本为样本二，解交联后，获得单核小体保护的cfdna和/或相邻核小体保护的长度在100-400bp之间的cfdna，

7、其中，获得单核小体保护的cfdna和/或相邻核小体保护的长度在100-400bp之间的cfdna的具体方法包括：

8、(a)将二抗与磁珠相连，获得带有二抗的磁珠；

9、(b)在所述样本二中加入组蛋白一抗及所述带有二抗的磁珠，获得单核小体保护的cfdna和/或相邻核小体保护的长度在100-400bp之间的cfdna。

10、本技术针对不同的cfdna片段情况，选取了不同的dna提取方式及染色质开放性捕获方式。对于单核小体保护的cfdna和/或相邻核小体保护的长度在100-400bp之间的cfdna，选取磁珠法进行提取；对于较短的直接游离的cfdna或较长的相邻核小体保护的长度不小于400bp的cfdna，使用酚氯仿方法进行提取。使用本方法能够对cfdna各个长度及核小体疏密程度下染色质开放性情况进行全面的捕获，获取到完整的染色质开放性信息。

11、使用本技术提出捕获不同片段大小的cfdna的方法，血浆中反应的基因组染色质开放区与组织染色质开放区呈现出较强的信号一致性，同时由于方法基于直接对染色质开放区的捕获，能够实现极高的分辨率及信噪比。本发明提出的cfatac-seq是一种无创、快捷、准确的基因组研究方法，它为基因的表达和调控以及细胞基因组结构及活性变化的研究提供了高效便捷的技术支持，这些研究可以为基因表达在某些疾病中的变化作出更好的诠释，从而为解决疾病问题提供了新的思路和方法。

12、本发明通过对血浆中染色质开放特征的直接捕获，可以以非侵入的方法对特征信息进行更简便的获取，进一步推进了该变异特征的临床及市场的应用。此外，本方法的发明突破了传统cfdna突变特征对测序深度的极高要求，替代以少数染色质开放性区域的较浅深度测序即能实现相同的疾病监测功能，极大的降低了cfdna在临床及市场中应用的成本。

13、根据本发明的实施方案，所述体液样本包括血浆、组织间隙液、淋巴液、脑脊液中的任意一种。

14、根据本发明的实施方案，所述体液样本包括源自鼠、兔、羊、灵长类哺乳动物中的任意一种。

15、根据本发明的实施方案，步骤(a)中，所述交联固定用到的试剂为甲醛，所述甲醛的浓度为0.1％-5％。

16、根据本发明的实施方案，所述甲醛的浓度为0.2％-4％。

17、根据本发明的实施方案，所述甲醛的浓度为1％。

18、根据本发明的实施方案，步骤(b)中，获得游离的不含核小体的cfdna和/或相邻核小体保护的长度不小于400bp的cfdna片段的方法为酚氯仿提取法。

19、根据本发明的实施方案，步骤(a)中，所述获得带有生物素二抗的磁珠的方法包括：将带有亲和素修饰的磁珠与生物素标记的二抗相连。

20、根据本发明的实施方案，所述亲和素为链酶亲和素。

21、根据本发明的实施方案，步骤(b)中，所述组蛋白一抗包括组蛋白h2a一抗、组蛋白h2b一抗、组蛋白h3一抗和组蛋白h4一抗中的任意一种。

22、根据本发明的实施方案，所述组蛋白一抗为组蛋白h3一抗。

23、根据本发明的实施方案，所述组蛋白一抗可以是任何适用于chip实验的抗体蛋白，包括灵长目源、鼠源的组蛋白一抗，优选为人的组蛋白一抗。

24、本发明第二方面提供一种构建cfdna文库的方法，所述方法包括：

25、(d)利用上述的捕获不同片段大小的cfdna的方法获得cfdna；

26、(e)对所述cfdna进行文库构建，

27、其中，

28、当所述cfdna为游离的不含核小体的cfdna和/或相邻核小体保护的长度不小于400bp的cfdna时，步骤(e)之前进一步包括：

29、(c)对步骤(b)中获得的不含核小体的cfdna和/或相邻核小体保护的长度不小于400bp的cfdna片段进行末端修饰及测序接头连接后进行文库扩增，获得cfdna文库1，

30、当所述cfdna为单核小体保护的cfdna和/或相邻核小体保护的长度在100-400bp之间的cfdna时，步骤(e)之前进一步包括：

31、(d)用酶作用于步骤(c)中获得的单核小体保护的cfdna和/或相邻核小体保护的长度在100-400bp之间的cfdna，获得片段化的cfdna；

32、(e)对所述片段化的cfdna进行扩增，获得cfdna文库2。

33、针对不同的cfdna片段情况，选取了不同的dna提取方式及染色质开放性捕获方式。对于单核小体保护的cfdna和/或相邻核小体保护的长度在100-400bp之间的中间长度的cfdna，选取cfdna提取试剂盒进行提取后进行tn5打断引入接头方式进行建库；对于较短直接游离的cfdna和/或相邻核小体保护的长度不小于400bp的cfdna，使用酚氯仿方法进行提取后用dna磁珠进行纯化，之后选用dna双链建库方法直接进行染色质开放性建库。使用本方法能够对cfdna各个长度及核小体疏密程度下染色质开放性情况进行全面的捕获，获取到完整的染色质开放性信息。

34、根据本发明的实施方案，步骤(c)中，所述的末端修饰包括对dna片段进行末端补齐后，在5’端加上磷酸化修饰，在3’端加上a碱基。

35、根据本发明的实施方案，测序接头包括illuminate平台的测序接头、mgi平台的测序接头中的任意一种。

36、根据本发明的实施方案，步骤(d)中，所述酶包括转座酶或内切酶。

37、根据本发明的实施方案，多的转座酶为tn5转座酶，所述内切酶为mnase或dnase酶。

38、根据本发明的实施方案，步骤(d)包括：利用转座酶对单核小体保护的cfdna和/或相邻核小体保护的长度在100-400bp之间的中间长度的cfdna进行转座反应，以将所述cfdna进行片段化并添加接头序列，获得包含接头序列的cfdna片段。

39、根据本发明的实施方案，步骤(d)包括：利用内切酶处理单核小体保护的cfdna和/或相邻核小体保护的长度在100-400bp之间的cfdna样本，以将所述cfdna进行片段化，然后在所得片段化dna的两端添加接头序列，获得包含接头序列的dna片段。

40、根据本发明的实施方案，所述测序接头包括illuminate平台的测序接头、mgi平台的测序接头中的任意一种。

41、本发明第三方面提供一种获得个体表观信息的方法，对第二方面所述的构建cfdna文库的方法获得的cfdna文库进行测序和分析，以获得个体表观信息。

42、使用本方法，血浆中反应的基因组染色质开放区与组织染色质开放区呈现出较强的信号一致性，同时由于方法基于直接对染色质开放区的捕获，能够实现极高的分辨率及信噪比。cfatac-seq是一种无创、快捷、准确的基因组研究方法，本技术提出的获得个体表观信息的方法为基因的表达和调控以及细胞基因组结构及活性变化的研究提供了高效便捷的技术支持，这些研究可以为基因表达在某些疾病中的变化作出更好的诠释，从而为解决疾病问题提供了新的思路和方法。

43、cfdna常以组蛋白保护的形式在血浆中免于被核酸酶降解而稳定存在，传统基于cfdna的检测方法仅对基因组信息进行检测，对cfdna包含的表观遗传信息探索较少。目前获得cfdna表观遗传信息的方法非常有限，且具有很大局限性。

44、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。