检测cyp2c19*17基因单核苷酸多态性的试剂、试剂盒及应用的制作方法

本发明属于基因检测，具体涉及检测cyp2c19*17基因单核苷酸多态性的试剂、试剂盒及应用。

背景技术：

1、药物个体化差异是指不同个体间药物疗效与安全性的不一致性，这种差异带来的后果可能是药物治疗效果不理想，耽误最佳治疗时间，又或是造成血药浓度过高，出现药物不良反应概率增大，严重危害患者生命健康。

2、研究表明，影响药物个体化差异的因素有很多，如体重，年龄，基础疾病，多药使用等。另外，基因突变引起的基因多态性作为造成药物作用个体差异更加重要的成因却尚未得到足够重视。而随着人类基因组学与药物基因组学的发展，越来越多的研究表明，药物个体化差异和基因多态性关系密切。一项数据显示，药物基因组学对药物疗效和安全性的影响概率高达80％。

3、具体来说，体内参与药物吸收和处置的药物代谢酶、转运蛋白及相关受体基因多态性的改变是导致药物反应个体差异的决定性因素。如cyp2c19酶是人体中重要的药物代谢酶，代谢多达15％已知的治疗窗口狭窄药物，包括华法林、氯吡格雷和卡马西平等。其编码基因的多态性导致cyp2c19酶活性的个体差异，使人群出现超快代谢者(um)、快代谢者(em)、中间代谢者(im)和慢代谢者(pm)4种表型。不同基因表型对其相应药物的代谢速率产生了不同影响，从而影响药效发挥或引发毒副作用。因此，在临床上根据基因表型的不同调整用药剂量对保障患者生命健康，提高药物治疗的安全性、有效性以及成本效益具有重要意义。

4、基于此，自2006年起，用于个体化用药指导的基因检测产品包括cyp2c9，cyp2d6等系列的药物代谢酶基因多态性检测试剂已于多国获批并上市使用。而我国国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心也于2019年发布了《cyp2c19药物代谢酶基因多态性检测试剂注册技术审查指导原则》对cyp2c19药物代谢酶基因多态性检测试剂的主要应用范围做出说明。截至到2021年，国际上已有5家机构发布针对112种药物涵盖27种相关基因的个体化临床用药剂量调整指南。

5、目前关于cyp2c19基因单核苷酸多态性的检测方法主要包括基因测序法、普通荧光定量pcr法、基因芯片检测法等等。然而上述方法均具有操作复杂，检测周期长，所需检测的仪器设备复杂等缺点，且检测结果特异性及灵敏度均较低。

技术实现思路

1、本发明的第一方面的目的，在于提供一种检测cyp2c19*17基因单核苷酸多态性的试剂。

2、本发明的第二方面的目的，在于提供一种试剂盒。

3、本发明的第三方面的目的，在于提供一种检测系统。

4、本发明的第四方面的目的，在于提供本发明第一方面的试剂、第二方面的试剂盒、和/或第三方面的检测系统的应用。

5、本发明的第五方面的目的，在于提供一种非疾病诊断治疗目的的检测cyp2c19*17基因单核苷酸多态性的方法。

6、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

7、本发明的第一个方面，提供一种检测cyp2c19*17基因单核苷酸多态性的试剂，包含：检测cyp2c19*17基因的探针和/或用于扩增cyp2c19*17基因的引物对；

8、所述检测cyp2c19*17基因的探针包括野生型探针和突变型探针；

9、所述野生型探针的序列如seq id no.19所示；

10、所述突变型探针的序列如seq id no.20所示；

11、所述野生型探针中的1个或多个位置的碱基被锁核酸修饰；

12、所述突变型探针中的1个或多个位置的碱基被锁核酸修饰；

13、所述用于扩增cyp2c19*17基因的引物对选自a)～f)中任意一组：

14、a)所述引物对的序列如seq id no.1、2所示；

15、b)所述引物对的序列如seq id no.3、4所示；

16、c)所述引物对的序列如seq id no.5、6所示；

17、d)所述引物对的序列如seq id no.7、8所示；

18、e)所述引物对的序列如seq id no.9、10所示；

19、f)所述引物对的序列如seq id no.11、12所示。

20、优选地，所述用于扩增cyp2c19*17基因的引物对选自a)～c)中任意一组。

21、优选地，所述用于扩增cyp2c19*17基因的引物对为b)。

22、优选地，所述野生型探针的5’端起第3位和第13位中的至少一个碱基被锁核酸修饰；进一步优选地，所述野生型探针的5’端起第3位和第13位的碱基被锁核酸修饰。

23、优选地，所述突变型探针的5’端起第3位和第13位中的至少一个碱基被锁核酸修饰；进一步优选地，所述突变型探针的5’端起第3位和第13位的碱基被锁核酸修饰。

24、优选地，所述野生型探针和突变型探针的两端分别标记有荧光报告基团、和荧光淬灭基团。

25、优选地，所述野生型探针和突变型探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

26、进一步优选地，所述野生型探针的5’端标记的荧光报告基团不同于突变型探针的5’端标记的荧光报告基团。

27、优选地，所述荧光报告基团为texas red、fam、hex、vic、rox和cy5中的至少一种。

28、优选地，所述荧光淬灭基团为bhq1、tamra、bbq-650、bhq2和bhq3中的至少一种。

29、优选地，所述野生型探针的5’端标记有cy5，所述突变型探针的5’端标记有texasred。

30、优选地，所述野生型探针和突变型探针的3’端标记有bhq2。

31、本发明的第二个方面，提供一种试剂盒，包含本发明第一个方面的试剂。

32、优选地，所述试剂盒还包含taq酶、dntps、mg2+和缓冲液中的至少一种。

33、优选地，所述试剂盒用于检测cyp2c19*17基因单核苷酸多态性。

34、本发明的第三个方面，提供一种检测系统，包含本发明第一个方面的试剂和第二个方面的试剂盒中的至少一种、以及荧光定量pcr仪。

35、优选地，所述检测系统用于检测cyp2c19*17基因单核苷酸多态性。

36、本发明的第四个方面，提供第一个方面的试剂、第二个方面的试剂盒、和/或第三个方面的检测系统在(1)～(2)中任一种中的应用；

37、(1)制备检测cyp2c19*17基因单核苷酸多态性的产品中的应用；

38、(2)非疾病诊断治疗目的的cyp2c19*17基因单核苷酸多态性检测。

39、本发明的第五个方面，提供一种非疾病治疗诊断目的的检测cyp2c19*17基因单核苷酸多态性的方法，包括采用本发明第一个方面的试剂、本发明第二个方面的试剂盒、和/或本发明第三个方面的检测系统的步骤。

40、优选地，所述方法包括如下步骤：

41、(1)样本提取：取待测样本，提取基因组；

42、(2)将步骤(1)的基因组与taq酶、dntps、mg2+、缓冲液、上述用于扩增cyp2c19*17基因的引物对和检测cyp2c19*17基因的探针混合，进行qpcr反应检测，读取检测信号。

43、优选地，步骤(2)中所述qpcr反应程序为：50℃5min；94℃30s；94℃5s，60℃30s，循环40～50次。

44、本发明的有益效果是：

45、本发明提供了一种检测cyp2c19*17基因单核苷酸多态性的试剂，包含：检测cyp2c19*17基因的探针和/或用于扩增cyp2c19*17基因的引物对；通过对上下游引物序列及探针序列进行相应优化，特异性增强；其中，检测cyp2c19*17基因的探针中的1个或多个位置的碱基被锁核酸修饰，锁核酸2’-o，4’-c位通过不同的缩水作用构成的亚甲基桥形成了刚性的缩合结构，增加了核酸磷酸骨架的局部结构的稳定性；并且锁核酸作为一种新的修饰后核酸，具有与dna/rna强大的杂交亲和力、反义活性、抗核酸酶能力、水溶性好和体内无毒性等特点；同时，锁核酸修饰的核酸应用于荧光定量pcr(qpcr)探针检测时，可有效提高检测反应退火温度并同时缩短检测所需探针的长度，即可以有效提高探针与dna模板结合特异性，并且较普通探针具有灵敏度更高，特异性更强等优势；同时，具有较强的抗干扰能力。

46、本发明提供的非疾病诊断治疗目的的检测cyp2c19*17基因单核苷酸多态性的方法，采用本发明提供的检测cyp2c19*17基因的探针和用于扩增cyp2c19*17基因的引物对，可检测低至1拷贝的样品。