一种高效巴雷特食管-化生型上皮类器官的培养方法

本发明属于培养基，尤其涉及一种高效巴雷特食管-化生型上皮类器官的培养方法。

背景技术：

1、目前，巴雷特食管(barret’s esophagus)是一种食管细胞病变的症状，是远端食管黏膜的鳞状上皮细胞由柱状上皮细胞所取代的病变，这种症状大多是由胃食管反流引起的，而巴雷特食管由50％以上会演变成食管腺癌，而食管腺癌的发生率在中国逐年提高。巴雷特食管作为腺癌的早期症状，基础研究尤为重要。类器官作为联系基础科研和临床疾病表征的重要材料，已经广泛服务于生物医药行业。由于巴雷特食管的病理学本质是鳞状上皮转变成为柱状上皮，在转变过程中，巴氏食管上皮兼具鳞状上皮和柱状上皮的特征，处于中间态。类器官培养中，鳞状上皮和柱状上皮的培养方式截然不同，需要的细胞因子也不同，这构成了巴氏食管类器官培养的技术壁垒。

2、现有的巴氏食管类器官培养方法主要依赖于使用栽培基进行培养，该栽培基包括dmem/f12，不含鳞状上皮的牛垂体提取物，也不含钙离子。此外，这种方法通常不涉及将培养基更换为ksfm。

3、现有技术存在的技术问题：

4、1.成熟和分化效率低：现有技术使用的dmem/f12培养基不适合所有类型的巴氏食管类器官，特别是化生型上皮类器官。这导致类器官成熟和分化的效率较低。

5、2.缺乏适当的刺激：现有的培养方法中，没有添加鳞状上皮的牛垂体提取物和钙离子，这些成分在细胞生长和分化过程中起着关键作用。缺乏这些刺激导致类器官形成的效率和质量受到限制。

6、3.类器官稳定性差：在没有更换为ksfm的情况下，现有的培养方法无法实现类器官的稳定培养和传代，这会影响到实验结果的可重复性和准确性。

7、综上所述，现有技术的主要问题在于，其采用的培养方法和培养基会导致类器官的成熟、分化和稳定性较差，从而影响实验结果的可靠性。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种高效巴雷特食管-化生型上皮类器官的培养方法。

2、本发明是这样实现的，一种高效巴雷特食管-化生型上皮类器官的培养方法，包括以下步骤：

3、第一步，采用柱状上皮类器官培养基对巴氏食管的类器官进行培养；

4、第二步，添加鳞状上皮的牛垂体提取物，形成空心状态的类器官；

5、第三步，培养基中加入了鳞状上皮分化用的钙离子，从dmem/f12变更成上皮专用培养基ksfm，实现了类器官的稳定培养和传代。

6、第一步：采用柱状上皮类器官培养基对巴氏食管的类器官进行培养。在这一步中，首先将获取的巴氏食管组织在包含柱状上皮类器官培养基的培养瓶中进行初级培养。此时，应维持适宜的温度和湿度条件，以便支持组织的生长和维持。

7、第二步：添加鳞状上皮的牛垂体提取物，形成空心状态的类器官。在此步骤中，将含有鳞状上皮所需的牛垂体提取物的培养基添加到培养瓶中。牛垂体提取物的添加有助于刺激组织形成空心状态的类器官结构。此步骤也应在维持适宜的温度和湿度条件下进行。

8、第三步：培养基中加入了鳞状上皮分化用的钙离子，从dmem/f12变更成上皮专用培养基ksfm，实现了类器官的稳定培养和传代。首先，将钙离子添加到培养基中，以促进鳞状上皮的分化。之后，将培养基从dmem/f12更换为上皮专用培养基ksfm，以进一步优化培养环境。此步骤的目标是通过优化培养条件，实现类器官的稳定培养和传代。在此过程中，需要定期换液、观察细胞生长情况，并在必要时进行传代操作。

9、本发明的另一目的在于提供一种用于巴氏食管类器官培养的系统，该系统包含柱状上皮类器官培养基，用于对巴氏食管的类器官进行初步培养；其中，系统进一步包括鳞状上皮所需的牛垂体提取物，用于刺激类器官形成空心状态；以及用于增加类器官形成数量的钙离子。

10、该系统的柱状上皮类器官培养基由dmem/f12更换为上皮专用培养基ksfm，以实现类器官的稳定培养和传代。

11、该系统包含以下组件：首先，使用柱状上皮类器官培养基对巴氏食管的类器官进行初步培养；其次，添加鳞状上皮的牛垂体提取物，形成空心状态的类器官；最后，将基础培养基从dmem/f12更换为上皮专用培养基ksfm，并向培养基中加入钙离子，实现类器官的稳定培养和传代。

12、使用含有适量氨基酸、矿物质、维生素和生长因子的柱状上皮类器官培养基，对从病人体内获取的巴氏食管的类器官进行初级培养；并在培养过程中加入含有鳞状上皮所需的牛垂体提取物的培养基，牛垂体提取物的浓度为0.1％-1％(v/v)，以刺激组织形成空心状态的类器官结构；最后，向培养基中加入钙离子，钙离子的浓度为0.5-2.5mm，然后将基础培养基从dmem/f12更换为上皮专用培养基ksfm，其中ksfm培养基包含适量的氨基酸、矿物质、维生素和生长因子，以实现类器官的稳定培养和传代。

13、结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：

14、第一，本发明从柱状上皮培养方式出发，逐渐添加鳞状上皮所需的营养因子，改善优化了培养方式，形成了高效的巴氏食管类器官培养体系。首先尝试了柱状上皮类器官培养基，对巴氏食管的类器官进行培养之后发现，该培养基不能从病人来源的组织单细胞形成类器官。再次基础上添加了鳞状上皮需要的牛垂体提取物，逐渐能形成空心状态的类器官，但是数量稀少，不能传代。进一步再培养基中加入了鳞状上皮分化用的钙离子，类器官形成数量变多，但是依旧不能传代。再进一步更换了基础培养基，从dmem/f12变更成上皮专用培养基ksfm，终于实现了类器官的稳定培养和传代。

15、本发明实现了巴氏食管类器官的成功培养；实现了巴氏食管类器官的传代，稳定培养；可以100％培养病人巴雷特食管样本的类器官培养。

16、本发明提高培养效率：新的培养方法会提高巴雷特食管-化生型上皮类器官的培养效率，使得这种类器官能在实验室条件下稳定地生长和传代。

17、模拟生理环境：通过模拟体内的环境(例如，使用柱状上皮类器官培养基和牛垂体提取物)，这种方法更接近巴雷特食管在体内的生理状态。

18、促进鳞状上皮分化：通过添加钙离子和更改培养基，这种方法促进鳞状上皮的分化，这对于理解和治疗巴雷特食管是非常重要的。

19、第二，本发明的获得的显著的技术进步主要集中在以下几个方面：

20、1.巴氏食管类器官的培养体系：本发明首次尝试使用柱状上皮类器官培养基对巴氏食管的类器官进行培养，这是一种新的探索和尝试。虽然最初的结果显示，该培养基不能从病人来源的组织单细胞形成类器官，但这个尝试为后续的改进和优化打下了基础。

21、2.添加牛垂体提取物：在基础上，本发明添加了鳞状上皮需要的牛垂体提取物，这使得类器官逐渐能形成空心状态，尽管数量稀少，但这是一个重要的进步。

22、3.添加鳞状上皮分化用的钙离子：在进一步的优化过程中，本发明在培养基中加入了鳞状上皮分化用的钙离子，使得类器官形成的数量有了显著的增加，这是另一个重要的改进点。

23、4.更换基础培养基：最后，本发明将基础培养基从dmem/f12更换成了上皮专用培养基ksfm，这一改变实现了类器官的稳定培养和传代，这是本发明的关键创新点。

24、综上，本发明通过对培养体系的逐步改进和优化，成功实现了巴氏食管类器官的稳定培养和传代，这是一个重大的创新和突破。