一种胆囊癌组织单细胞悬液的制备方法及应用

本发明属于细胞分离，具体涉及一种用于胆囊癌肿瘤组织解离的方法，特别是涉及一种新鲜胆囊癌组织解离获得单细胞悬液的方法及应用。

背景技术：

1、胆囊癌是胆道系统最常见的恶性肿瘤。胆囊癌具有症状隐匿、发展速度快、早期转移、预后差等恶性肿瘤的典型特征，发现时多已属晚期或进展期。

2、胆囊癌的研究因为受到疾病罕见性和获取新鲜样本困难性的阻碍，所以目前关于胆囊癌的发病机制、疾病进展、治疗等方面的研究进展缓慢。单细胞测序技术是研究正常和病变组织的一项革命性工具，可以解读不同状态下细胞的异质性，为分析细胞分化和细胞间相互作用的轨迹以及系统发育提供了可能性，有助于发现新的细胞类型和新的生物学过程。针对肿瘤这类异质性极高的组织来说，通过单细胞技术来解析肿瘤微环境中复杂细胞类型的相互作用已成为当前研究热点，通过单细胞多组学解析肿瘤细胞和免疫细胞及其他微环境中的成分、比例、状态等从而阐明肿瘤生物行为的潜在机制。因此单细胞测序技术的出现能加快对胆囊癌的深入认识。然而由于单细胞测序需要获得大量原始组织的高质量(活率80％以上)的单细胞悬液，并且期望获得的细胞类型尽可能贴近原始组织的细胞类型和比例。然而当前的胆囊癌肿瘤组织解离方法获得的单细胞悬液整体细胞数有限、活率偏低、结团率较高，使得影响后续的单细胞测序，因此获得高质量的单细胞悬液有利于提高测序结果的质量。

3、由于单细胞测序需要借助较为昂贵的设备和试剂，且胆囊癌的发病率不高，获得的样本十分珍贵，而待测序样本通过提取、文库构建、高通量测序等各个实验步骤都会存在失败的风险，因此开发一种高效的、高细胞活率的、高细胞数的可用于单细胞测序的胆囊癌单细胞悬液的制备方法有利于提高单细胞实验的成功率，且该方法能够在低成本下实现单细胞快速提取，为高水平研究奠定基础，加快单细胞实验在胆道肿瘤研究中的应用。

技术实现思路

1、为了克服现有技术中胆囊癌单细胞悬液活率低、数量少的情况，本发明提供了一种操作简单快速，并且能够获得高细胞活率和细胞数的能够用于单细胞测序的胆囊癌组织处理和解离方法，以解决现存在的问题。

2、本申请的方案如下：

3、一种胆囊癌组织单细胞悬液的制备方法，包括以下步骤：

4、(1)胆囊癌组织预处理；

5、(2)酶解：采用解离液对步骤(1)中获得的预处理后的肿瘤组织进行酶解和孵育；

6、(3)离心收集：终止酶解后过滤收集细胞悬液，清洗；

7、(4)红细胞裂解：用红细胞裂解液对步骤(3)获得的细胞沉淀进行红细胞裂解，清洗离心，获得细胞沉淀；

8、(5)根据用途和分析设备要求选取介质重悬步骤(4)所得的细胞沉淀，稀释至目标浓度，即得到胆囊癌单细胞悬液。

9、进一步地，步骤(1)中预处理过程为：获取组织后快速转移至实验室，通过冲洗、修剪肿瘤组织，完成后将组织剪碎。

10、进一步地，冲洗采用的清洗液为预冷的加入双抗的基础培养基dmem。

11、进一步地，步骤(2)中所述的解离液为：胶原酶ⅰ、胶原酶ⅳ、dnaseⅰ。

12、进一步地，步骤(3)酶解后过滤的剩余沉淀加入解离液，重复操作进行多次酶解。

13、进一步地，终止酶解使用的是fbs。

14、进一步地，步骤(4)中红细胞裂解时间为5min，所述裂解温度为室温。

15、上述制备方法制备得到的胆囊癌组织单细胞悬液。

16、上述胆囊癌组织单细胞悬液的应用，其特征在于：所述的应用为单细胞测序、和/或单细胞流式分析或分选、和/或在单细胞蛋白组中的应用。

17、本发明的原理：

18、ⅰ型胶原酶通常适用于上皮、脾、肺等均一松软组织的解离，ⅳ型胶原酶用于胰腺、胎盘等组织的解离，dna酶降解dna，避免分离过程中破碎细胞释放的dna增加悬液粘度，通过该三种酶的联合使用可以高效且充分的解离胆囊癌组织。本发明中的ⅰ型和ⅳ型胶原酶在一定的比例下配制成的解离液可以快速获得高活率的胆囊癌单细胞悬液。

19、不同的肿瘤组织，不同的解离液处理获得的单细胞悬液效果不同。本发明选用的胶原酶适于消化纤维性组织以及上皮性癌组织。胆囊癌是纤维化非常严重的肿瘤，通常解离得不到数量较多的活细胞，本发明得到的细胞活率高，细胞亚群分类多，有助于生信分析得到促进胆囊癌发生发展的新亚群。

20、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

21、本发明的制备方法制备所得胆囊癌单细胞悬液细胞得率高：80mg左右胆囊癌组织样本解离后得到的细胞数可达到106个细胞；细胞活率高，aopi镜下计数，细胞活率可达到85％-95％；可满足市面上各大公司单细胞测序的上机标准。

22、本发明的方法获得的单细胞悬液有效避免了细胞粘连及聚团。

23、本发明的方法不需要其他试剂盒对活细胞进行分选或富集，因此节约了成本，降低操作复杂度和时长；

24、本发明的方法可以根据裂解所得灵活选择解离的次数，且不需要高度专业化的设备、试剂或技能，便于操作和实施，具有良好的实际应用价值。

技术特征：

1.一种胆囊癌组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的胆囊癌组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，步骤(1)中预处理过程为：获取组织后快速转移至实验室，通过冲洗、修剪肿瘤组织，完成后将组织剪碎。

3.根据权利要求2所述的胆囊癌组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，冲洗采用的清洗液为预冷的加入双抗的基础培养基dmem。

4.根据权利要求1所述的胆囊癌组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的解离液为：胶原酶ⅰ、胶原酶ⅳ、dnaseⅰ。

5.根据权利要求1所述的胆囊癌组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，步骤(3)酶解后过滤的剩余沉淀加入解离液，重复操作进行多次酶解。

6.根据权利要求1所述的胆囊癌组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，终止酶解使用的是fbs。

7.根据权利要求1所述的胆囊癌组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，步骤(4)中红细胞裂解时间为5min，所述裂解温度为室温。

8.一种权利要求1-7任一所述的制备方法制备得到的胆囊癌组织单细胞悬液。

9.权利要求8所述的胆囊癌组织单细胞悬液的应用，其特征在于：所述的应用为单细胞测序、和/或单细胞流式分析或分选、和/或在单细胞蛋白组中的应用。

技术总结
本发明属于细胞分离技术领域，具体涉及一种用于胆囊癌肿瘤组织解离的方法，特别是涉及一种新鲜胆囊癌组织解离获得单细胞悬液的方法及应用。Ⅰ型胶原酶通常适用于上皮、脾、肺等均一松软组织的解离，Ⅳ型胶原酶用于胰腺、胎盘等组织的解离，DNA酶DnaseⅠ降解DNA，避免分离过程中破碎细胞释放的DNA增加悬液粘度，通过该三种酶的联合使用可以高效且充分的解离胆囊癌组织。操作简便，无需特殊仪器设备即可实现，可于短时间内获得高活性的胆囊癌单细胞悬液，经细胞活性检测发现，新鲜肿瘤组织所分离得到的单细胞产量高达1.2x10<supgt;6</supgt;/mL，活率高达94.8％。

技术研发人员：高飞,张琦,张文,高开
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15