一种三环吡唑嘧啶亚芳基酯类衍生物及其用途

本发明涉及一种三环吡唑嘧啶亚芳基酯类衍生物及其用途。该类化合物经细胞活性筛选，结果表明：有25个化合物对hct116结肠癌细胞有抑制活性，有25个化合物对hgc27胃癌细胞有抑制活性。

背景技术：

1、癌症，是恶性肿瘤的俗称，是一类严重危害人类生命健康的疾病。近年来癌症的发生率和致死率呈不断上升趋势，根据世界卫生组织国际癌症研究机构发布最新数据显示，2020年全球新增癌症病例约1930万、死亡人数约1000万。因此，寻找高效的新型抗肿瘤药物已成为当前癌症治疗研究非常重要且急迫的课题。

2、抗肿瘤小分子靶向制剂具有高靶向性、疗效显著的特点，从而提高患者的生存质量，现已成为临床用药中倍受瞩目的种类。在医学领域上，以哌啶和嘧啶为代表的饱和杂环类化合物早就被人们所熟知，并且在美国fda橙书中列出的所有小分子治疗药物中，它们是目前最具有代表性的饱和杂环体系。在此基础上，在分子中再引入一些如苯、吡咯、吡唑、嘧啶和吡啶等非纯芳香族或异芳香族的环状体系，总会取得一些意外的效果，包括在分子量略有增加的基础上可以提供更大的多样性(通过立体异构作用)，同时也可以进一步丰富该类化合物结构上的新颖性。因此，药物分子的结构也在逐步发生着变化，并且以杂环为代表的饱和环系统越来越引起人们的重视。

3、嘧啶或嘧啶酮片段因其独特的结构可以组成各种碱基，所以是生命科学领域中不可缺少的一类重要分子。如果嘧啶与五元杂环结合在一起，将在药物设计开发过程中提供更为广泛的含氮基团。

4、本课题组长期从事杂环化合物的合成和抗肿瘤构效关系以及天然化合物的抗肿瘤多药耐药逆转活性研究等工作。m.chauhan等人用吡唑基团取代噻吩环并合成了一系列新的三环吡唑[3,4-d]嘧啶类衍生物，发现吡唑[3,4-d]嘧啶类化合物具有多种生物活性，如抗菌、抗炎、抗病毒等，同时，酶抑制活性筛选发现吡唑[3,4-d]嘧啶类化合物也可以作为各种激酶抑制剂，尤其在作为pde9a抑制剂方面效果更好。目前大多数报道的已完成阿尔茨海默病的ii期临床试验pde9a抑制剂，都含有吡唑嘧啶酮骨架。另一方面，最新设计的吡唑[3,4-d]嘧啶类化合物显示出良好的抗肿瘤活性，并作为化疗药物的先导化合物进一步深入研究。

5、参考文献

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17、本课题组长期从事吡唑[3,4-d]吡唑并嘧啶酮类化合物的合成及生物活性研究，研究表明[3,4-d]吡唑并嘧啶酮类化合物具有抗肿瘤活性。寻找和探索吡唑[3,4-d]吡唑并嘧啶酮类化合物的合成方法与生物活性对于发现新药与先导化合物具有较大的理论和应用价值。本发明在国内外相关专利和文献的分析基础上，结合本课题组前期研究工作，对吡唑[3,4-d]吡唑并嘧啶酮类化合物进行结构改造和修饰，将不同种类的杂环和取代基引入到吡唑[3,4-d]吡唑并嘧啶酮类化合物中，提高其抗肿瘤活性与成药性，并研究了这些化合物对hct116结肠癌细胞、hgc27胃癌细胞的抑制活性，以发现高效低毒的抗肿瘤候选药物。

18、本发明对吡唑[3,4-d]吡唑并嘧啶酮类化合物进行取代基修饰以及利用药物设计原理，探究其抗肿瘤活性。活性筛选结果表明：有29个化合物对hct116结肠癌细胞有抑制活性；有29个化合物对hgc27胃癌细胞有抑制活性；

技术实现思路

1、本发明的目的在于，提供一种三环吡唑嘧啶亚芳基酯类衍生物及其用途，所述衍生物以5-氨基-1-甲基吡唑-4-甲酸乙酯为初始原料，与2-氮己环酮在三氯氧磷的催化下进行反应，得到1-甲基-6,7,8,9-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-4(1h)-酮(a)，在乙醇溶液中加入等量的3,4,5-三甲氧基苯甲醛和催化量的氢氧化钠，加热回流得到单取代化合物(e)-1-甲基-9-(3,4,5-三甲氧基亚苄基)-6,7,8,9-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-4(1h)-酮(b)，然后以浓度40％氢溴酸的乙酸溶液为溶剂回流反应得到(e)-9-(4-羟基-3,5-二甲氧基亚苄基)-1-甲基-6,7,8,9-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-4(1h)-酮(c)，最后，在催化量碱的作用下，与不同取代的酰氯反应得到目标(e)-9-(4-羟基-3,5-二甲氧基亚苄基)-1-甲基-6,7,8,9-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-4(1h)-酮衍生物(d1-d23),此外，化合物(e1-e3)是化合物(b)在不同条件下脱氢或硫代得到。化合物(f1-f3)是在1,5,6-三甲基-1,5-二氢-4h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮与不同醛在碱性条件下得到。考察了上述化合物抗肿瘤活性，结果表明：以阿霉素(dox)为阳性对照药，29个化合物对hct116结肠癌细胞有抑制活性，29个化合物对hgc27胃癌细胞有抑制活性。

2、本发明所述的一种三环吡唑嘧啶亚芳基酯类衍生物，该衍生物的结构为：

3、

4、其中：

5、化合物d1为(e)-2,6-二甲氧基-4-((1-甲基-4-氧代-1,4,7,8-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-9(6h)-亚基)甲基)苯基戊酸酯；

6、化合物d2为(e)-2,6-二甲氧基-4-((1-甲基-4-氧代-1,4,7,8-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-9(6h)-亚基)甲基)苯基十二酸酯；

7、化合物d3为(e)-2,6-二甲氧基-4-((1-甲基-4-氧代-1,4,7,8-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-9(6h)-亚基)甲基)苯基异丁酸酯；

8、化合物d4为(e)-2,6-二甲氧基-4-((1-甲基-4-氧代-1,4,7,8-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-9(6h)-亚基)甲基)苯基特戊酸酯；

9、化合物d5为(e)-2,6-二甲氧基-4-((1-甲基-4-氧代-1,4,7,8-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-9(6h)-亚基)甲基)苯基4-溴苯甲酸酯；

10、化合物d6为(e)-2,6-二甲氧基-4-((1-甲基-4-氧代-1,4,7,8-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-9(6h)-亚基)甲基)苯基4-(三氟甲基)苯甲酸酯；

11、化合物d7为(e)-2,6-二甲氧基-4-((1-甲基-4-氧代-1,4,7,8-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-9(6h)-亚基)甲基)苯基4-(三氟甲氧基)苯甲酸酯；

12、化合物d8为(e)-2,6-二甲氧基-4-((1-甲基-4-氧代-1,4,7,8-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-9(6h)-亚基)甲基)苯基2-氟苯甲酸酯；

13、化合物d9为(e)-2,6-二甲氧基-4-((1-甲基-4-氧代-1,4,7,8-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-9(6h)-亚基)甲基)苯基环丙烷甲酸酯；

14、化合物d10为(e)-2,6-二甲氧基-4-((1-甲基-4-氧代-1,4,7,8-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-9(6h)-亚基)甲基)苯基4-氰基苯甲酸酯；

15、化合物d11为(e)-2,6-二甲氧基-4-((1-甲基-4-氧代-1,4,7,8-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-9(6h)-亚基)甲基)苯基4-甲基苯甲酸酯；

16、化合物d12为(e)-2,6-二甲氧基-4-((1-甲基-4-氧代-1,4,7,8-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-9(6h)-亚基)甲基)苯基3-氟苯甲酸酯；

17、化合物d13为(e)-2,6-二甲氧基-4-((1-甲基-4-氧代-1,4,7,8-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-9(6h)-亚基)甲基)苯基4-氯苯甲酸酯；

18、化合物d14为(e)-2,6-二甲氧基-4-((1-甲基-4-氧代-1,4,7,8-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-9(6h)-亚基)甲基)苯基3-氯苯甲酸酯；

19、化合物d15为(e)-2,6-二甲氧基-4-((1-甲基-4-氧代-1,4,7,8-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-9(6h)-亚基)甲基)苯基3-溴苯甲酸酯；

20、化合物d16为(e)-2,6-二甲氧基-4-((1-甲基-4-氧代-1,4,7,8-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-9(6h)-亚基)甲基)苯基4-(叔丁基)苯甲酸酯；

21、化合物d17为(e)-2,6-二甲氧基-4-((1-甲基-4-氧代-1,4,7,8-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-9(6h)-亚基)甲基)苯基4-硝基苯磺酸酯；

22、化合物d18为(e)-2,6-二甲氧基-4-((1-甲基-4-氧代-1,4,7,8-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-9(6h)-亚基)甲基)苯基4-氟苯磺酸酯；

23、化合物d19为(e)-2,6-二甲氧基-4-((1-甲基-4-氧代-1,4,7,8-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-9(6h)-亚基)甲基)苯基4-(三氟甲氧基)苯磺酸酯；

24、化合物d20为(e)-2,6-二甲氧基-4-((1-甲基-4-氧代-1,4,7,8-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-9(6h)-亚基)甲基)苯基4-溴苯磺酸酯；

25、化合物d21为(e)-2,6-二甲氧基-4-((1-甲基-4-氧代-1,4,7,8-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-9(6h)-亚基)甲基)苯基4-氰基苯磺酸酯；

26、化合物d22为(e)-2,6-二甲氧基-4-((1-甲基-4-氧代-1,4,7,8-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-9(6h)-亚基)甲基)苯基4-(叔丁基)苯磺酸酯；

27、化合物d23为(e)-2,6-二甲氧基-4-((1-甲基-4-氧代-1,4,7,8-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-9(6h)-亚基)甲基)苯基2-(三氟甲基)苯甲酸酯；

28、化合物e1为(e)-1-甲基-9-(3,4,5-三甲氧基亚苄基)-6,7,8,9-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-4(1h)-硫酮；

29、化合物e2为1-甲基-9-(3,4,5-三甲氧基苄基)-6,7,8,9-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-4(1h)-酮；

30、化合物e3为(e)-9-(4-羟基-3,5-二甲氧基亚苄基)-1-甲基-6,7,8,9-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-4(1h)-酮；

31、化合物f1为(e)-1,5-二甲基-6-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1,5-二氢-4h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮；

32、化合物f2为(e)-1,5-二甲基-6-(2,4,6-三甲氧基苯乙烯基)-1,5-二氢-4h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮；

33、化合物f3为(e)-6-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯乙烯基)-1,5-二甲基-1,5-二氢-4h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮。

34、所述三环吡唑嘧啶亚芳基酯类衍生物中的化合物d1、d2、d3、d4、d5、d6、d7、d8、d9、d10、d11、d12、d13、d14、d15、d16、d17、d18、d19、d20、d21、d22、d23、e1、e2、e3、f1、f2、f3在制备治疗hct116结肠癌药物中的用途。

35、所述三环吡唑嘧啶亚芳基酯类衍生物中的化合物d1、d2、d3、d4、d5、d6、d7、d8、d9、d10、d11、d12、d13、d14、d15、d16、d17、d18、d19、d20、d21、d22、d23、e1、e2、e3、f1、f2、f3在制备治疗hgc27胃癌药物中的用途。

36、本发明所述的三环吡唑嘧啶亚芳基酯类衍生物的制备方法，按下列步骤进行：

37、化合物a的制备：

38、将5-氨基-1-甲基吡唑-4-甲酸乙酯20g，118.2mmol溶解在150ml的无水1，2-二氯乙烷中，加入2-氮己环酮23.4g,236.4mmol,然后缓慢滴加三氯氧磷45.32g,295.6mmol,在温度80℃回流反应8小时，tlc检测原料反应完全，反应液倒入200ml水中淬灭，加入naoh水溶液将ph调到7，然后加入乙酸乙酯(50ml×3)分液萃取，合并有机相用100ml饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，干燥后的产物用50ml四氢呋喃打浆得到白色固体化合物a为1-甲基-6,7,8,9-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-4(1h)-酮22.1g，产率91.7％。

39、化合物b的制备：

40、将1-甲基-6,7,8,9-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-4(1h)-酮(化合物a)10g,49.0mmol溶解在150ml甲醇中，加入氢氧化钠3.92g，98.0mmol和3,4,5-三甲氧基苯甲醛14.41g，73.4mmol，在温度90℃下回流反应8小时，tlc检测反应完全，将反应液直接过滤，滤饼用分别用30ml甲醇、30ml乙酸乙酯洗涤，得到淡黄色固体化合物b为e)-9-(4-羟基-3,5-二甲氧基亚苄基)-1-甲基-6,7,8,9-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-4(1h)-酮15.1g，收率80.1％。

41、化合物c的制备：

42、将(e)-9-(4-羟基-3,5-二甲氧基亚苄基)-1-甲基-6,7,8,9-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-4(1h)-酮(化合物b)10g,26.1mmol溶解在100ml的40％氢溴酸的乙酸溶液中，在温度90℃下回流反应1小时，tlc检测反应完全，在反应液中加入100ml水淬灭，有固体沉淀析出后过滤，滤饼用分别用30ml甲醇洗涤2次，得到黄色固体化合物c为(e)-9-(4-羟基-3,5-二甲氧基亚苄基)-1-甲基-6,7,8,9-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-4(1h)-酮8.2g，收率85.5％。

43、化合物d1-d23的制备：

44、将得到的(e)-9-(4-羟基-3,5-二甲氧基亚苄基)-1-甲基-6,7,8,9-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-4(1h)-酮(化合物c)0.54mmol溶解在无水二氯甲烷中，然后滴加缚酸剂三乙胺1.30mmol和催化剂4-二甲氨基吡啶0.27mmol，温度0℃下缓慢滴加用二氯甲烷稀释后的酰氯0.81mmol，室温搅拌1h，tlc监测反应完毕，加水除去过量的酰氯，二氯甲烷(5ml×3)萃取，饱和食盐水10ml洗涤，无水硫酸钠干燥，合并有机相，浓缩，硅胶柱层析纯化，采用洗脱剂体积比1:1的石油醚:乙酸乙酯洗脱，得到目标化合物d1-d23。

45、化合物e1的制备：

46、将(e)-1-甲基-9-(3,4,5-三甲氧基亚苄基)-6,7,8,9-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-4(1h)-酮(化合物b)200mg,0.52mmol溶解在5ml的甲苯溶液中，加入劳森试剂317.30mg，0.78mmol，在温度90℃下回流反应8小时，tlc检测反应完全，在反应液中分别加入10ml水，乙酸乙酯(10ml×3)萃取，合并有机相用15ml饱和食盐水洗涤，浓缩干燥，硅胶柱层析纯化，采用洗脱剂体积比为3:1的石油醚和乙酸乙酯洗脱，得到黄色固体化合物e1157.0mg，收率75.6％。

47、化合物e2的制备：

48、将(e)-1-甲基-9-(3,4,5-三甲氧基亚苄基)-6,7,8,9-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-4(1h)-酮(化合物b)200mg,0.98mmol溶解在5ml的甲醇溶液中，加入钯碳50mg,在室温下反应8小时，tlc检测反应完全，直接过滤反应液除去钯碳，浓缩反应液，得到黄色固体化合物e2 180.0mg，收率90％；

49、化合物e3的制备：

50、将(e)-9-(4-羟基-3,5-二甲氧基亚苄基)-1-甲基-6,7,8,9-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-4(1h)-酮(化合物b)10g,26.1mmol溶解在100ml的40％氢溴酸的乙酸溶液中，在温度90℃下回流反应1小时，tlc检测反应完全，在反应液中加入100ml水淬灭，有固体沉淀析出后过滤，滤饼用分别用30ml甲醇洗涤2次，得到黄色固体化合物e3为(e)-9-(4-羟基-3,5-二甲氧基亚苄基)-1-甲基-6,7,8,9-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-4(1h)-酮8.2g，收率85.5％。

51、化合物f1的制备：

52、第一步：将5-氨基-1-甲基吡唑-4-甲酸乙酯5g，29.55mmol溶解在70ml的无水1，2-二氯乙烷中，加入n-甲基乙酰胺3.24g,44.33mmol,然后缓慢滴加三氯氧磷11.33g，73.89mmol,在温度80℃回流反应8小时，tlc检测原料反应完全，反应液倒入100ml水中淬灭，加入naoh水溶液将ph调到7，然后加入乙酸乙酯(30ml×3)分液萃取，合并有机相，用100ml饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，干燥后的产物用50ml四氢呋喃打浆得到白色固体化合物1,5,6-三甲基-1,5-二氢-4h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(化合物f0)4.8g，产率91.1％；

53、第二步：将1,5,6-三甲基-1,5-二氢-4h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(化合物f0)200mg，1.12mmol溶解在5ml甲醇中，加入氢氧化钠89.79mg，2.24mmol，和3,4,5-三甲氧基苯甲醛330.30mg，1.68mmol，在温度90℃下回流反应8小时，tlc检测反应完全，将反应液直接过滤，滤饼用分别用10ml甲醇、10ml乙酸乙酯洗涤，得到浅绿色固体化合物f1(e)-1,5-二甲基-6-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1,5-二氢-4h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮180mg，收率45.1％；

54、化合物f2的制备：

55、将1,5,6-三甲基-1,5-二氢-4h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(化合物f0)200mg，1.12mmol溶解在5ml甲醇中，加入氢氧化钠89.79mg，2.24mmol，和2,4,6-三甲氧基苯甲醛330.30mg，1.68mmol，在温度90℃下回流反应8小时，tlc检测反应完全，将反应液直接过滤，滤饼用分别用10ml甲醇、10ml乙酸乙酯洗涤，得到浅绿色固体化合物f2(e)-1,5-二甲基-6-(2,4,6-三甲氧基苯乙烯基)-1,5-二氢-4h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮175mg，收率43.75％；

56、化合物f3的制备：

57、将化合物f1(e)-1,5-二甲基-6-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1,5-二氢-4h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮50mg，0.140mmol溶解在5ml 40％氢溴酸的乙酸溶液中，在温度90℃下回流反应1小时，tlc检测反应完全，在反应液中加入100ml水，有固体沉淀析出后过滤，滤饼用分别用3ml甲醇洗涤两次，得到黄色固体化合物f3(e)-6-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯乙烯基)-1,5-二甲基-1,5-二氢-4h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮21mg，收率39.1％。

58、本发明所述的一种三环吡唑嘧啶亚芳基酯类衍生物，是以5-氨基-1-甲基吡唑-4-甲酸乙酯为初始原料，经过三步反应得到单取代的(e)-9-(4-羟基-3,5-二甲氧基亚苄基)-1-甲基-6,7,8,9-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-4(1h)-酮(c)，然后在催化量碱的作用下，与不同取代的酰氯反应得到目标(e)-9-(4-羟基-3,5-二甲氧基亚苄基)-1-甲基-6,7,8,9-四氢吡唑并[3,4-d]吡啶并[1,2-a]嘧啶-4(1h)-酮衍生物(d1-d23)，合成路线如下：

59、

60、该类化合物经体外活性筛选结果表明：以阿霉素(dox)为阳性对照药，29个化合物都有较好抗癌活性(ic50<5μm)，其中24个化合物表现出很好的抑制hct116结肠癌细胞的活性(ic50<1μm)，尤其d2，d3，d4，d9,d11,d14,e3活性最好(ic50＝0.01μm)，其中26个化合物表现出很好的抑制hgc27胃癌细胞的活性(ic50<1μm)，尤其d3，d7，d8，d9,d15,e3,活性最好(ic50等于或小于0.05μm)。