结合PD-1的抗体及其用途的制作方法

本发明总体上涉及分离的单克隆抗体，特别是小鼠、嵌合或人源化的单克隆抗体，其以高亲和力和功能性特异性结合人pd-1。本发明还提供了编码抗体的核酸分子、表达载体、宿主细胞和用于表达抗体的方法。本发明进一步提供了免疫缀合物(immunoconjugate)、双特异性分子、溶瘤病毒和包含该抗体的药物组合物，以及使用本发明的抗pd-1抗体的诊断和治疗方法。

背景技术：

1、程序性细胞死亡蛋白1，也称为pd-1或cd279，是t细胞调节剂cd28家族的成员，并在活化的b细胞、t细胞和髓样细胞上表达(agata et al.,(1996)int immunol 8:765-72；okazaki et al.,(2002)curr.opin.immunol.14:391779-82；bennett et al.,(2003)jimmunol 170:711-8)。它包含膜近端免疫受体酪氨酸抑制基序(itim)和膜远端基于酪氨酸的开关基序(itsm)(thomas,m.l.(1995)j exp med 181:1953-6；vivier,e and daeron,m(1997)immunol today 18:286-91)。已经鉴定出pd-1的两个配体pd-l1和pd-l2，两者都是与pd-1结合但不与其他cd28家族成员结合的b7同源物。

2、几条证据表明pd-1及其配体负调节免疫反应。例如，发现pd-1在多种人类癌症中丰富(dong et al.,(2002)nat.med.8:787-9)。此外，据报道pd-1和pd-l1之间的相互作用引起肿瘤浸润淋巴细胞和t细胞受体介导的增殖的减少，以及癌细胞的免疫逃避(dong etal.,(2003)j.mol.med.81:281-7；blank et al.,(2005)cancer immunol.immunother.54:307-314；konishi et al.,(2004)clin.cancer res.10:5094-100)。研究还表明，通过抑制pd-1与pd-l1的局部相互作用可以逆转免疫抑制作用，并且当pd-1与pd-l2的相互作用也被阻断时，这种作用是加和的(iwai et al.,(2002)proc.nat'l.acad.sci.usa 99:12293-7；brown et al.,(2003)j.immunol.170:1257-66)。

3、pd-1缺陷的动物可能发展出各种自身免疫表型，包括自身免疫性心肌病和具有关节炎和肾炎的狼疮样综合征(nishimura et al.,(1999)immunity 11:141-51；nishimuraet al.,(2001)science 291:319-22)。另外，已经发现pd-1在自身免疫性脑脊髓炎、系统性红斑狼疮、移植物抗宿主病(gvhd)、i型糖尿病和类风湿性关节炎中起作用(salama etal.,(2003)j exp med 198:71-78；prokunina and alarcon-riquelme(2004)hum molgenet 13:r143；nielsen et al.,(2004)lupus 13:510)。在小鼠b细胞肿瘤细胞系中，pd-1的itsm被证明对于阻断bcr介导的ca2+通量和下游效应子分子的酪氨酸磷酸化是必不可少的(okazaki et al.,(2001)pnas 98:13866-71)。

4、已经开发了许多靶向pd-1的癌症免疫治疗剂用于疾病治疗。一种此类抗pd-1抗体是nivolumab(由bristol myers squibb以商品名出售)，其在总共296名患者的临床试验中在非小细胞肺癌、黑色素瘤和肾细胞癌中产生了全部或部分反应(topalian slet al.,(2012)the new england journal of medicine.366(26):2443–54)。它于2014年在日本获得批准，并于2014年被美国fda批准用于治疗转移性黑色素瘤。靶向pd-1的另一种抗pd-1抗体pembrolizumab(keytrudatm,mk-3475,merck)也已于2014年获得美国fda的批准，用于治疗转移性黑色素瘤。在美国，它已用于肺癌、淋巴瘤和间皮瘤的临床试验中。

5、尽管已经开发和批准了抗pd-1抗体，但仍需要具有对pd-1增强的结合亲和力和其他所需药物特性的其他单克隆抗体。

技术实现思路

1、本发明提供了分离的单克隆抗体，例如小鼠、人、嵌合或人源化的单克隆抗体，其与pd-1结合(例如人pd-1和猴pd-1)并且具有增加的与pd-1的亲和力，并且与现有的抗pd-1抗体(例如nivolumab)相比，具有相当(若非更好)的抗肿瘤效果。

2、本发明的抗体可用于多种应用，包括检测pd-1蛋白以及治疗和预防pd-1相关疾病，例如癌症、自身免疫性心肌病、自身免疫性脑脊髓炎、系统性红斑狼疮、移植物抗宿主病(gvhd)、i型糖尿病和类风湿关节炎。

3、相应地，在一方面，本发明涉及与pd-1结合的分离的单克隆抗体(例如小鼠、嵌合或人源化抗体)或其抗原结合部分，其具有重链可变区，该重链可变区包含cdr1区、cdr2区和cdr3区，其中所述cdr1区、cdr2区和cdr3区包含分别与(1)seq id no：1、2和3；(2)seq idno：4、5和6；(3)seq id no：7、8和9；(4)seq id no：10、11和12；(5)seq id no：13、14和15；(6)seq id no：16、17和18；(7)seq id no：19、20和21；(8)seq id no：22、23和24；(9)seqid no：25、26和27；(10)seq id no：28、29和30；或(11)seq id no：31、32和33具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；其中所述抗体或其抗原结合片段结合pd-1。

4、在一方面，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链可变区，该重链可变区包含具有与seq id no：67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78或79具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其中所述抗体或其抗原结合片段结合至pd-1。seq id no：67和69-79可以分别由seq id no：102-113的核酸序列编码。

5、在一方面，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含轻链可变区，该轻链可变区包含cdr1区、cdr2区和cdr3区，其中所述cdr1区、cdr2区和cdr3区域包含分别与(1)seq id no：34、35和36；(2)seq id no：37、38和39；(3)seq id no：40、41和42；(4)seqid no：43、44和45；(5)seq id no：46、47和48；(6)seq id no：49、50和51；(7)seq id no：52、53和54；(8)seq id no：55、56和57；(9)seq id no：58、59和60；(10)seq id no：61、62和63；或(11)seq id no：64、65和66具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；其中所述抗体或其抗原结合片段结合pd-1。

6、在一方面，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含轻链可变区，该轻链可变区包含具有与seq id no：80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95或96具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其中所述抗体或其抗原结合片段结合至pd-1。seq id no：80和86-96可以分别由seq id no：114-125的核酸序列编码。

7、在一方面，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，每个重链可变区和轻链可变区都包含cdr1区、cdr2区和cdr3区，其中重链可变区cdr1、cdr2和cdr3以及轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3包含分别与以下序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：(1)seq id no：1、2、3、34、35和36；(2)seq id no：4、5、6、37、38和39；(3)seq id no：7、8、9、40、41和42；(4)seq id no：10、11、12、43、44和45；(5)seq id no：13、14、15、46、47和48；(6)seq id no：16、17、18、49、50和51；(7)seq id no：19、20、21、52、53和54；(8)seq id no：22、23、24、55、56和57；(9)seq idno：25、26、27、58、59和60；(10)seq id no：28、29、30、61、62和63；或(11)seq id no：31、32、32、64、65和66，其中所述抗体或其抗原结合片段结合pd-1。

8、在一个实施方案中，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区和轻链可变区包含分别与以下序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：(1)seq id no：67和80；(2)seq idno：68和81；(3)seq id no：69和81；(4)seq id no：68和82；(5)seq id no：68和83；(6)seqid no：68和84；(7)seq id no：68和85；(8)seq id no：68和86；(9)seq id no：69和86；(10)seq id no：70和87；(11)seq id no：71和88；(12)seq id no：72和89；(13)seq id no：73和90；(14)seq id no：74和91；(15)seq id no：75和92；(16)seq id no：76和93；(17)seq idno：77和94；(18)seq id no：78和95；或(19)seq id no：79和96，其中所述抗体或其抗原结合片段结合pd-1。

9、在一个实施方案中，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，重链包含重链可变区和重链恒定区，轻链包含轻链可变区和轻链恒定区，其中重链恒定区包含与seq id no：97、99或129具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且轻链恒定区包含与seq idno：98或130具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，重链可变区和轻链可变区包含上述氨基酸序列，其中抗体或其抗原结合片段与pd-1结合。seq id no：97和99的这些氨基酸序列可以分别由seq id no：126和128的核酸序列编码。seq id no：98可以由seq id no：127编码。

10、在一些实施方案中，本发明的抗体包含两条重链和两条轻链或由两条重链和两条轻链组成，其中每个重链包含上述重链恒定区、重链可变区或cdr序列，并且每个轻链包含上述轻链恒定区、轻链可变区或cdr序列，其中抗体与pd-1结合。本发明的抗体可以是全长抗体，例如igg1、igg2或igg4同种型。在其他实施方案中，本发明的抗体可以是单链抗体或抗体片段，例如fab或fab'2片段。

11、本发明的抗体或其抗原结合部分比现有技术的抗pd-1抗体(例如nivolumab)具有更高的对人pd-1的结合亲和力，其以6.36×10-9m或更少的kd结合人pd-1，并抑制pd-l1与pd-1的结合。与现有抗pd-1抗体(例如nivolumab)相比，本发明的抗体或其抗原结合部分也提供相当的抗肿瘤效果(若非更好)。

12、本发明还提供了免疫缀合物，其包含与治疗剂(例如细胞毒素)连接的本发明的抗体或其抗原结合部分。本发明还提供了双特异性分子，其包含本发明的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分与具有不同于所述抗体或其抗原结合部分的结合特异性的第二功能部分(例如第二抗体)连接。另一方面，可以将本发明的抗体或其抗原结合部分制成嵌合抗原受体(car)的一部分。本发明的抗体或其抗原结合部分也可以由溶瘤病毒编码或与溶瘤病毒结合使用。

13、本发明还提供了组合物，其包含本发明的抗体或其抗原结合部分、或免疫缀合物、双特异性分子、溶瘤病毒、或car，以及药学上可接受的载体。

14、本发明还包括编码本发明的抗体或其抗原结合部分的核酸分子，以及包含此类核酸的表达载体和包含此类表达载体的宿主细胞。还提供了一种使用包含表达载体的宿主细胞制备抗pd-1抗体的方法，其包括以下步骤：(i)在宿主细胞中表达抗体，和(ii)从宿主细胞或其细胞培养物中分离抗体。

15、在另一方面，本发明提供了在对象中调节免疫应答的方法，其包括向对象施用本发明的抗体或其抗原结合部分，从而调节对象中的免疫应答。优选地，本发明的抗体增强、刺激或增加对象的免疫应答。在一些实施方案中，所述方法包括施用本发明的组合物、双特异性分子、免疫缀合物、car-t细胞、或编码抗体或带有抗体的溶瘤病毒、或能够在对象中表达它们的核酸分子。

16、在另一方面，本发明提供了在对象中抑制肿瘤生长的方法，包括向对象施用治疗有效量的本发明的抗体或其抗原结合部分。肿瘤可以是实体瘤或非实体瘤，包括但不限于淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、结肠腺癌、胰腺癌、结肠癌、胃肠癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子宫颈癌、乳腺癌、肺癌、肾细胞癌和鼻咽癌。在一些实施方案中，该方法包括施用本发明的组合物、双特异性分子、免疫缀合物、car-t细胞、或编码抗体或带有抗体的溶瘤病毒、或者能够在对象表达它们的核酸分子。

17、在另一方面，本发明提供了一种在对象中治疗感染性疾病的方法，其包括向对象施用治疗有效量的本发明的抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，该方法包括施用本发明的组合物、双特异性分子、免疫缀合物、car-t细胞、或编码抗体或带有抗体的溶瘤病毒、或者能够在对象表达它们的核酸分子。

18、更进一步地，本发明提供了一种在对象中增强对抗原的免疫应答的方法，其包括向对象施用：(i)抗原；(ii)抗体或其抗原结合部分，从而增强对象对抗原的免疫应答。抗原可以是例如肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、或来自病原体的抗原。

19、本发明的抗体可以与至少一种其他试剂组合使用，该试剂例如是免疫刺激抗体(例如抗pd-l1抗体和/或抗ctla-4抗体)、细胞因子(例如il-2和/或il-21)、或共刺激抗体(例如抗cd137和/或抗gitr抗体)。

20、通过下面的详细描述和实施例，本公开的其他特征和优点将变得显而易见，其不应被解释为限制性的。在本技术中引用的所有参考文献、genbank条目、专利和公开的专利申请的内容通过引用明确地并入本文。