一种用于检测丙戊酸钠代谢相关基因的引物探针组、试剂盒、检测方法及应用与流程

本发明涉及基因检测，特别涉及一种用于检测丙戊酸钠代谢相关基因的引物探针组、试剂盒、检测方法及应用。

背景技术：

1、癫痫俗称“羊角风”或“羊癫风”，是由多种病因引起的神经元异常放电导致的最常见的脑部慢性疾病，其特征为重复性和自发性，对患者的大脑、神经及其他组织器官均有不同程度的损害，严重影响患者身心健康和生活质量。据中国最新流行病学资料显示，国内癫痫的总体患病率为7.0‰，年发病率为28.8/10万，1年内有发作的活动性癫痫患病率为4.6‰，在中国癫痫已经成为神经科仅次于头痛的第二大常见病。

2、目前，丙戊酸钠作为广谱抗癫痫药物是临床上治疗癫痫疾病常用的一线治疗药物，虽然其口服吸收迅速，生物利用度高，但其治疗窗窄，药物反应呈现较大的个体差异，诸多研究证实丙戊酸钠药物反应差异除了包括年龄、体重、肝肾功能等生理病理因素，基因多态性对其影响颇深。研究资料显示，丙戊酸钠在人体内主要经肝脏代谢，主要代谢途径有3条：约10％左右经cyp450酶系氧化代谢(cyp450)；约50％经葡糖醛酸酶代谢(ugts)；约40％左右经线粒体内β氧化代谢，其余1％～3％以原型经尿液排出。其中，cyp2c9位于10q23.3号染色体，长度约390kb，其多态性可导致酶活性的改变，影响丙戊酸钠代谢，导致血药浓度的个体差异，cyp2c9*3(1075a＞c)c等位基因是癫痫的易感基因。此外，线粒体聚合酶γ(polg1)基因所编码的polg是唯一位于线粒体并参与与线粒体dna复制与修复的酶，其基因突变会影响线粒体的功能，导致难治性癫痫并且polg基因的罕见突变可引起alpers-huttenlocher综合征，已经证明polg突变与丙戊酸钠诱导的肝毒性有直接关系，polgc.3708g>t突变与丙戊酸钠诱发的肝衰竭有关，具有polg c.3428a>g突变纯合子的患者存在寿命缩短、严重者面临死亡的风险，且杂合突变患者肝衰竭预后更差。因此polg c.3708g>t和polg c.3428a>g基因分型识别出存在致命后果的高风险个体对降低药物的不良反应具有重要的临床意义。

3、目前，现有技术中关于检测癫痫疾病相关基因多态性位点的技术绝大多数均采用飞行时间质谱技术，如中国专利号cn109468379a，公开了采用飞行时间质谱技术检测抗癫痫类药物相关的基因的snp位点，其检测过程涉及先通过pcr扩增出含有snp位点的一段dna，然后用sap酶去除掉pcr体系中剩余的dntp和引物，再加入一单碱基延伸引物进行延伸反应，最后进行质谱分析。整个检测过程对dna的纯度要求特别高，步骤繁琐，操作环境和设备都有一定的要求，对操作人员的要求比较高且需要精密的检测设备，成本高；此外，中国专利号cn113136424b公开了采用下一代基因测序技术检测用于抗癫痫药物个体化用药的基因突变位点，虽然该方法具备高通量、多位点的优势，但是存在步骤繁琐，试验周期长、成本高、检测项目较为冗余等问题，不利于临床大面积推广的缺点。目前大多数研究均忽略了polg c.3428a>g位点的检测，而polg c.3428a>g位点的突变则与丙戊酸钠用药引起的不良反应之一致命风险相关，因此开发出操作简单、费用低廉且同时检测cyp2c9 c.1075a>c、polg c.3708g>t和polg c.3428a>g的检测试剂盒是十分有必要的。本发明基于arms pcr检测技术致力于开发一种操作简单、特异性强、灵敏度高、可靠性强且成本低的检测方案。

技术实现思路

1、本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种用于检测丙戊酸钠代谢相关基因的引物探针组、试剂盒、检测方法及应用，以解决现有技术问题存在的不足。

2、本发明采用的技术方案如下：一种用于检测丙戊酸钠代谢相关基因的引物探针组，包括用于检测cyp2c9 c.1075a>c、polg c.3708g>t和polg c.3428a>g位点的arms引物探针组合物，arms引物探针组合物的核苷酸序列如表1所示：

3、表1

4、

5、其中，所述用于检测cyp2c9 c.1075a>c位点的arms引物探针组合物为：核苷酸序列如seq id no.1所示的正向野生型引物，核苷酸序列如seq id no.2所示的正向突变型引物，核苷酸序列如seq id no.3所示的通用引物以及核苷酸序列如seq id no.4所示的荧光探针；

6、所述用于检测polg c.3708g>t位点的arms引物探针组合物为：核苷酸序列如seqid no.5所示的正向野生型引物，核苷酸序列如seq id no.6所示的正向突变型引物，核苷酸序列如seq id no.7所示的通用引物，核苷酸序列如seq id no.8所示的荧光探针；

7、所述用于检测polg c.3428a>g位点的arms引物探针组合物为，核苷酸序列如seqid no.9所示的正向野生型引物，核苷酸序列如seq id no.10所示的正向突变型引物，核苷酸序列如seq id no.11所示的通用引物，核苷酸序列如seq id no.12所示的荧光探针。

8、进一步，所述荧光探针的5’端连接有荧光基团，其3’端连接有淬灭基团，所述荧光基团选自fam、hex、texas red和cy5其中任意一种荧光染料，所述淬灭基团选自bhq1或者bhq2。

9、进一步，本发明还包括一种用于检测丙戊酸钠代谢相关基因的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物探针组、用于处理待测样本的核酸释放剂、阳性对照和阴性对照。

10、进一步，所述试剂盒还包括用于检测人基因组dna内标基因通用引物和通用探针，所述内标基因选自rpph，所述检测人基因组dna内标基因通用引物的核苷酸序列如表1中的seq id no.13-14所示，所述通用探针的核苷酸序列如表1中的seq id no.15所示。

11、进一步，所述用于处理待测样本核酸释放剂包括sds、甲酰胺、hcl组分；所述阳性对照为所有目标基因靶序列多态性位点的dna重组质粒；所述阴性对照为生理盐水。

12、进一步，用于检测cyp2c9 c.1075a>c位点的正向野生型引物、通用引物和荧光探针，与用于检测polg c.3708g>t位点的正向突变型引物、通用引物和荧光探针，与用于检测polg c.3428a>g位点的正向野生型引物、通用引物和荧光探针，与pcr缓冲液共混形成预混液1；

13、所述用于检测cyp2c9 c.1075a>c位点的正向突变型引物、通用引物和荧光探针，与用于检测polg c.3708g>t位点的正向野生型引物、通用引物和荧光探针，与用于检测polg c.3428a>g位点的正向突变型引物、通用引物和荧光探针，与pcr缓冲液共混形成预混液2。

14、在上述引物探针组中，预混液1和预混液2中设计了2种不同的反应体系，预混液1和预混液2中均包含了野生型引物探针组以及突变型引物探针组，发明人发现，预混液1和预混液2中为单一反应体系时，容易发生因多重pcr中的不同扩增片段互相竞争资源，单孔目标基因过多，导致某通道扩增曲线存在被压制情况，而构建2种不同的反应体系后，则很好的规避了该问题。

15、进一步，所述pcr缓冲液包括tris-hcl、5*含甘油buffer、10*buffer、taq酶、mgcl2和dntps。

16、进一步，在预混液1中，用于检测cyp2c9 c.1075a>c位点的正向野生型引物和通用引物的含量分别为0.03μl-0.07μl；用于检测polg c.3708g>t位点的正向突变型引物和通用引物的含量分别为0.03μl-0.07μl；用于检测polg c.3428a>g位点的正向野生型引物和通用引物的含量分别为0.03μl-0.07μl；

17、在预混液2中，所述用于检测cyp2c9 c.1075a>c位点的正向突变型引物和通用引物的含量分别为0.03μl-0.06μl；用于检测polg c.3708g>t位点的正向野生型引物和通用引物的含量分别为0.03μl-0.07μl，用于检测polg c.3428a>g位点的正向突变型引物和通用引物的含量分别为0.03μl-0.06μl。

18、进一步，本发明还包括一种上述试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

19、a、采用所述用于处理待测样本核酸释放剂释放待测样本的dna；

20、b、在所述预混液1、预混液2中直接加入所述步骤s1处理后的待测样本进行充分混匀；

21、c、荧光定量pcr扩增反应程序为：

22、预变性反应：95℃反应3min；

23、扩增反应：95℃反应15s，60℃反应45s，45个循环；

24、d、待测样本基因型判定。

25、进一步，本发明还包括一种上述试剂盒在基因分型检测方面的应用，所述应用以非诊断或非治疗为目的。

26、综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

27、1、本发明针对与丙戊酸钠代谢相关的cyp2c9 c.1075a>c、polg c.3708g>t和polgc.3428a>g位点设计了arms引物、taqman探针并配合pcr缓冲液体系，可准确检测低至0.1ng/μl的基因组dna，灵敏度较高；通过引入内参基因，对检测过程进行全程质量监控，有效避免假阳性或者假阴性；

28、2、本发明通过对pcr反应体系一和pcr反应体系二中的各位点的特异性引物和公用引物的添加量进行优化以及针对同一反应体系中检测各位点的引物的类型的组合探究，使得反应体系中各位点的扩增效率保持一致，减少了因相互竞争资源各位点扩增过程中压制现象；

29、3、本发明的检测试剂盒提供全预混形式的预混液1和预混液2，明显简化了pcr反应体系的配制步骤，操作更加便捷，减少了操作误差，方便用户使用、准确度高；同时提供的核酸释放剂，实现了全血样本的核酸免提取处理步骤；

30、4、本发明的检测技术方法相对于市面上其它检测方法极大降低了操作强度，可实现1小时左右出结果，为丙戊酸钠药物的使用提供了更完善的个性化风险预测参考，使患者受益。