一种启动子PM311及其应用

：本发明属于微生物与基因工程，具体涉及一种突变启动子pm311及其应用。

背景技术

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背景技术：

1、启动子是指一段能使基因进行转录的dna序列，包括核心启动子区和调控区域。在转录起始时，启动子与rna聚合酶、调控基因转录的转录因子产生相互作用，进而控制基因转录的起始时间和程度。

2、实现异源蛋白的高效表达的关键因素之一是使用高强度且易控制的启动子。具有强度可预知、鲁棒性强的启动子的筛选、优化显的尤为重要。

3、α-淀粉酶启动子pamye作为常用的表达元件，已在枯草芽胞杆菌及其亲缘关系较近的底盘菌株中实现多种工业酶的发酵生产，例如，蛋白酶、淀粉酶、磷脂酶、果聚糖酶等。然而，葡萄糖介导的碳分解代谢物抑制(ccr)是阻遏启动子pamye在表达系统中应用的主要问题，参与这一全局调控的联级反应包括：特征性顺式活性序列(cre，分解代谢物反应元件)和反式作用蛋白(ccpa，分解代谢物控制蛋白)识别cre元件，负调控相应基因的转录。有报道称，通过ccpa蛋白上结合启动子的结合基序进而达到调节碳源代谢的目的。例如，在地衣芽孢杆菌中突变ccpa蛋白的关键氨基酸lys31，ile42和leu56，在葡萄糖存在的前提下，提高了木糖的利用率；通过随机突变ccpa蛋白，系统的重新连接全局碳、氮代谢的调控网络，在枯草芽孢杆菌中实现最佳的营养摄入并提高异源蛋白的产量；这些结果为ccpa介导调节的分子基础提供了新的见解。尽管ccpa蛋白的突变或缺失可以缓解或解除ccr的阻遏作用，但却对生长可能产生不利影响，这是由于ccpa蛋白不仅对碳源代谢进行调控，而且在氮代谢、磷代谢、脂代谢等都有重要的调控作用。

4、相较于分子水平上调整ccpa蛋白，通过改造启动子的cre元件，对于缓解全局调控因子ccpa蛋白介导的ccr效应是一种最直接、最有效的策略。所以cre元件介导的ccr效应是微生物适应不断变化环境时最重要的机制之一，并且在枯草芽孢中，已经鉴定出50多个cre序列，提出了一个共识的cre序wtgnaancgnwnncw(w:a/t，n:a/g/c/t)。

5、因此，本申请以上述共识的cre序列作为参考模板，在启动子pamye的序列中寻找假定的cre元件，并设计突变引物，对α-淀粉酶启动子pamye的cre元件进行pcr扩增和突变，获得新的启动子突变体，以期提高异源蛋白的高效表达。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、为了解决上述技术问题，本发明将以枯草芽孢杆菌来源的α-淀粉酶启动子pamye为基础，通过分子生物学手段对其进行突变，从而筛选出有利于氨肽酶外源表达的启动子突变体。

2、本发明提供的技术方案之一，是一种突变的启动子pm311，所述启动子pm311，其核苷酸序列如seq id no：2所示。

3、本发明提供的技术方案之二，是一种包含所述启动子pm311的表达载体；所述表达载体的骨架可以是任何本领域已知的芽胞杆菌的表达载体，包括但不限于pht01、pht43、phcmc05、pwb980等；

4、根据本发明一种优选的实施方式，所述表达载体是pwb980。

5、本发明提供的技术方案之三，是包含技术方案一所述启动子或技术方案二所述表达载体的表达系统，所述表达系统采用的宿主可以是适合于本发明的启动子或表达载体的任何宿主，例如解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌。

6、根据本发明一种优选的实施方式，所述宿主是解淀粉芽胞杆菌(b.amyloliquefaciens)cgmcc no.11218、枯草芽孢杆菌(b.subtilis)wb600、枯草芽孢杆菌(b.subtilis)wb800。

7、本发明提供的技术方案之四，是启动子pm311的应用，特别是在控制蛋白表达中的应用，更特别的是在控制氨肽酶表达中的应用，更特别的是应用于解淀粉芽孢杆菌为宿主的蛋白表达中的应用；

8、根据本发明一种优选的实施方式，所述启动子pm311用于控制氨肽酶基因ywad在解淀粉芽孢杆菌系统中的表达；

9、进一步地，所述氨肽酶的氨基酸序列如seq id no：4所示。

10、有益效果：

11、本发明通过对枯草芽孢杆菌来源的启动子分析改造获得了一种突变启动子pm311。本发明所述突变启动子pm311实现了氨肽酶的高效异源表达，其活力是1201.53u/ml，相较于原始启动子，氨肽酶酶是对照菌pamye-ap重组氨肽酶活力的2.36倍，为进一步实现氨肽酶ywad的高效表达提供了参考依据，同时也为氨肽酶的工业化生产奠定基础。

技术特征：

1.一种启动子，其特征在于，所述启动子为启动子pm311，核苷酸序列如seq id no：2所示。

2.包含权利要求1所述启动子pm311的重组质粒。

3.如权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的骨架包括但不限于pht01、pht43、phcmc05、pwb980等。

4.包含权利要求1所述启动子pm311，或包含权利要求2所述重组质粒的表达系统。

5.如权利要求4所述的表达系统，其特征在于，所述表达系统采用的宿主包括：解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌。

6.权利要求1所述启动子pm311的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，是在控制蛋白表达中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述蛋白为氨肽酶。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述氨肽酶基酸序列如seq id no：4所示。

技术总结
本发明属于微生物与基因工程技术领域，具体涉及一种启动子PM311及其应用。所述启动子PM311，是通过对枯草芽孢杆菌来源的启动子分析改造获得的，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明所述突变启动子PM311实现了氨肽酶的高效异源表达，相较于原始启动子，氨肽酶酶活提高了136％，为进一步实现氨肽酶YwaD的高效表达提供了参考依据，同时也为氨肽酶的工业化生产奠定基础。

技术研发人员：李玉,路福平,郭洁洁,史超硕,刘业学,刘逸寒
受保护的技术使用者：天津科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/29