一种编码M1R保护性抗体的mRNA及其应用

本发明涉及一种编码m1r保护性抗体的mrna及其应用，具体地说，涉及一种编码抗猴痘病毒m1r蛋白特异性抗体的mrna分子及其在制备抗正痘病毒感染的药物中的应用；属于生物。

背景技术：

1、正痘病毒属(orthopoxvirus)归类于痘病毒科(poxviridae)脊索动物痘病毒亚科(chordopoxvirinae)，成员包括可感染人和哺乳动物的多种痘病毒。其中，目前已知的对人类致病的正痘病毒有4种：天花病毒、痘苗病毒、牛痘病毒和猴痘病毒，并且这4种病毒的基因组同源性大于90％，存在交叉保护作用。特别是自2022年5月以来，英国、葡萄牙等多个非猴痘流行国家相继出现猴痘确诊病例，随着病例数不断增加、分布范围日益扩散，加之人际传播、社区传播的确认，2022年7月23日，世界卫生组织宣布猴痘疫情为“国际关注的突发公共卫生事件”，正痘病毒感染开始引起全球公共卫生领域的密切关注。当前，我国尚无获批特异性抗正痘病毒药物，主要是对症支持和并发症的治疗。研发安全高效的特异性药物以有效应对潜在的正痘病毒感染威胁十分必要。

2、中和抗体药物靶向性强、特异性高，可直接与病毒表面蛋白结合，阻断病毒感染，在人群暴露于病毒前后均能发挥保护效果，是传染病防治的有效手段。然而，传统蛋白抗体药物开发往往依赖于细胞培养，生产周期长、工艺复杂、成本高昂。与蛋白质相比，核酸的理化特点相对简单，易于制备纯化并且成本低。将编码特定抗体的信使核糖核酸(mrna)分子通过递送系统导入生物体内，以机体细胞作为生物反应器来表达相应的抗体进而发挥其生物学功能的策略，不仅能够有效减少由抗体体外表达翻译异常修饰引起的异质性及抗体的错误折叠，并且可以有效地避免抗体复杂的体外生产及纯化过程，易于实现快速及大规模生产。

3、mrna疫苗是通过将编码保护性抗原的mrna分子递送至体内，进而在机体内表达出相应抗原以刺激机体产生特异性体液免疫反应产生抗体，并且往往需要至少2次免疫接种以获得理想的抗体水平，因此多用于疾病的预防。不同于mrna疫苗，mrna抗体是通过将编码保护性抗体的mrna分子递送至机体内直接产生抗体，在暴露前和暴露后均可使用，兼具疾病预防和治疗的效果。

4、正痘病毒在复制过程中存在2种不同形式的感染性病毒颗粒：细胞外包膜病毒(extracellular enveloped virion，eev)和细胞内成熟病毒(intracellular maturevirion，imv)。这些表面结构蛋白主要负责病毒粘附、进入、包装和复制等，也是激活宿主体液免疫反应的主要蛋白。以猴痘病毒为例，其imv表面蛋白m1r是病毒复制所需关键蛋白之一，并且参与病毒粒子组装，在病毒进入和成熟过程中发挥重要作用。研究同时也发现，猴痘病毒m1r高度保守，与痘苗病毒l1r、天花病毒m1r等高度同源，彼此之间存在交叉保护。

5、在现有技术中，针对m1r的具有交叉中和活性的抗体已有报道。美国陆军传染病医学研究院的研究人员基于编码抗痘苗病毒l1r蛋白的人-鼠嵌合抗体c7d11的基因序列，进一步构建了mrna抗体，通过肌肉注射兔后可在其体内产生抗体，但是血清中和抗体水平低，不太可能提供抗痘病毒感染的攻毒保护，未实现预期的技术效果。这一研究结果表明，利用mrna技术基于现有抗体序列开发mrna抗体存在技术效果的不可预期性。当前，尚无能够提供抗正痘病毒感染保护的编码抗m1r蛋白抗体的mrna分子相关报道。

技术实现思路

1、为克服现有技术存在的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种编码m1r保护性抗体的mrna，所述mrna为一种具有抗正痘病毒感染活性的编码抗m1r蛋白抗体的mrna，将所述mrna递送至生物体内后，能够在体内表达针对m1r蛋白的保护性单克隆抗体并分泌至血液循环中，起到保护机体抵御正痘病毒感染的作用。

2、本发明的目的之二在于提供一种编码m1r保护性抗体的mrna的应用，所述应用为在制备抗正痘病毒感染的药物中的应用。

3、为实现本发明的目的，提供以下技术方案。

4、一种编码m1r保护性抗体的mrna，所述mrna由构建物a和构建物b组成：

5、构建物a为编码抗猴痘病毒imv表面蛋白m1r的单克隆抗体mab26的轻链mrna构建物(简称为：mrna-mab26-lc)，按照正义链，即5'→3'方向，依次包括如下元件：

6、5’帽结构、5’非编码区(5’utr)、人源抗体卡帕轻链信号肽、抗体mab26轻链、3’非编码区(3’utr)和多聚腺苷酸序列(poly a)；

7、构建物b为编码抗猴痘病毒imv表面蛋白m1r的单克隆抗体mab26的重链mrna构建物(简称为：mrna-mab26-hc)，按照正义链，即5'→3'方向，依次包括如下元件：

8、5’帽结构、5’非编码区(5’utr)、人源抗体卡帕轻链信号肽、抗体mab26重链、3’非编码区(3’utr)和多聚腺苷酸序列(poly a)。

9、其中，所述5’utr的核苷酸序列为：

10、cuuguucuuuuugcagaagcucagaauaaacgcucaacuuuggc；

11、在序列表中如seq id no：3所示。

12、所述人源抗体卡帕轻链信号肽的氨基酸序列为：

13、melglswifllailkgvqc；

14、在序列表中如seq id no：4所示。

15、所述人源抗体卡帕轻链信号肽的核苷酸序列为：

16、auggagcugggacugagcuggauuuuucugcuggccauucugaagggggugcagugc；

17、在序列表中如seq id no：5所示。

18、所述抗体mab26轻链的氨基酸序列为：

19、qsaltqppsasgspgqsvtitctgsssdvggynyvswyqqhpgkapkvviyevnkrpsgvphrfsgsksgntasltvsglqaedeadyycssyagtetvafgggtkltvlgqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs；

20、其中，cdr1、cdr2、cdr3用下划线标出；在序列表中如seq id no：6所示。

21、所述抗体mab26轻链的核苷酸序列为：

22、caguccgcccugacccagccccccagcgccagcggcagccccggccagagcgugaccaucaccugcacaggguccagcagcgacguggggggcuacaacuacgugagcugguaccagcagcaccccggcaaggccccuaaggucgugaucuacgaggugaacaagcggcccuccggggucccccaccgguucuccgggagcaaguccgggaacaccgccagccugacagugagcgggcuccaggccgaggaugaggccgacuacuacugcuccagcuacgccggcaccgagacaguggccuucggcgggggcacuaagcugaccgugcugggccagccuaaggccgcccccuccgugacacuguucccacccuccagcgaggagcugcaggccaacaaggccacccuggugugccugaucuccgacuucuacccuggggccgugaccguggccuggaaggccgauagcagccccgugaaggccggcguggagacaacaacacccagcaagcagagcaacaacaaguacgccgccagcagcuaccugucccugacccccgagcaguggaagucccacaggagcuacagcugccaggucacccacgagggcagcacaguggaaaagacaguggcccccacagagugcagc；

23、其中，cdr1、cdr2、cdr3用下划线标出；在序列表中如seq id no：7所示。

24、所述抗体mab26重链的氨基酸序列为：

25、qvqlvqsgggliqpggslrlscvvsgfnvatnymswvrqapgkglewvsviysggstyyadsvkgrftisrdnskntvflqmnslrpedtaayycakggglgldywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlyitrepevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk；

26、其中，cdr1、cdr2、cdr3用下划线标出；在序列表中如seq id no：8所示。

27、所述抗体mab26重链的核苷酸序列为：

28、cagguccagcugguccaaagcggcggcgggcucauucagcccggcgggucccugcggcucucuugugucgugagcggcuucaacguggccaccaacuacaugagcugggugaggcaggcccccggcaaggggcuggagugggugagcgugaucuacagcggcggcuccaccuacuacgccgacuccgugaaggggagguuuacuauuagccgggacaacagcaagaacacaguguuccugcagaugaacucccugcggcccgaggauacagccgccuacuacugcgccaagggcgggggccuggggcuggauuacugggggcagggcacccucgugaccgugagcagcgccagcaccaagggccccuccguguucccccuggcccccagcagcaaguccaccagcggcgggacagccgcccuggggugccuggugaaggauuacuuucccgagccagugacagugagcuggaacuccggggcccugacaagcggcgugcacacauuccccgccgugcuccaguccuccgggcucuacagccuguccuccgucgugaccgugccauccagcagccuggggacacagaccuacaucugcaacgugaaccacaagcccagcaacacaaagguggauaagcggguggagcccaaguccugcgauaagacacacacaugcccccccugccccgcccccgaggccgccggcgggccuagcguguuucuguucccccccaagcccaaggacacccuguacaucaccagggagcccgaggugaccugcguggugguggaugugagccacgaagauccugaggugaaguuuaacugguacguggacgggguggaggugcacaacgccaagaccaagcccagggaggagcaguacaacagcacauaccggguggugagcgugcugaccgugcugcaccaggacuggcugaacgggaaggaguacaagugcaaggugagcaacaaggcccuccccgcccccaucgagaaaaccaucuccaaggccaaggggcagccacgggagccccagguguacacccugcccccaagcagggaggagaugacaaagaaccaggugucccugacaugccuggugaagggguuuuaccccuccgacaucgccguggagugggagagcaacgggcagcccgagaacaacuacaagaccacccccccugugcuggacagcgacgggagcuucuuccuguacuccaagcugacagucgauaagagccgguggcagcagggcaacguguucagcugcagcgugaugcacgaggcccugcacaaccacuacacacagaagucccugagccucagcccagggaag；

29、其中，cdr1、cdr2、cdr3用下划线标出；在序列表中如seq id no：9所示。

30、本发明的cdr分析依据网站http://www.abysis.org/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi完成。

31、3’utr的核苷酸序列为：

32、uaggcuggagccucgguggccaugcuucuugccccuugggccuccccccagccccuccuccccuuccugcacccguacccccguggucuuugaauaaagucugagugggcggcacuagu；

33、在序列表中如seq id no：10所示。

34、根据不同mrna的需求，可在mrna的5’端灵活添加不同的5’帽结构，如m7gpppg、m27,3’-ogpppg、m7gppp(5’)n1和m7gppp(m2’-o)n1中的至少一种。

35、在本发明的一些优选的实施方案中，所述5'帽结构为m7gpppg。

36、“m7g”代表7-甲基鸟苷帽核苷，“ppp”代表帽核苷的5’端和初级rna转录物的第一个核苷酸之间的三磷酸键，n1是最5’端的核苷酸，“g”代表鸟嘌呤核苷，“m7”代表在鸟嘌呤的7-位上的甲基，“m2’-o”代表核苷酸2’-o位上的甲基。

37、所述多聚腺苷酸序列(poly a)可以包含50个～400个腺苷酸，优选包含100个～160个腺苷酸。

38、所述mrna中部分或全部的尿嘧啶和/或胞嘧啶进行了能够提高所述mrna在生物体内稳定性的化学改性。

39、所述化学改性包括利用以下物质置换所述mrna中的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的尿嘧啶。

40、其中，置换尿嘧啶的物质选自假尿苷、n1-甲基假尿苷、n1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4’-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫基t-甲基-假尿苷、2-硫基-5-氮杂-尿苷、2-硫基-二氢假尿苷、2-硫基-二氢尿苷、2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷和2'-o-甲基尿苷中的至少一种，优选假尿苷、n1-甲基假尿苷或n1-乙基假尿苷，进一步优选n1-甲基假尿苷；和/或，

41、所述化学改性包括利用5-甲基胞嘧啶置换所述mrna中的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的胞嘧啶。

42、优选构建物a的核苷酸序列为：

43、cuuguucuuuuugcagaagcucagaauaaacgcucaacuuuggcgccgccaccauggagcugggacugagcuggauuuuucugcuggccauucugaagggggugcagugccaguccgcccugacccagccccccagcgccagcggcagccccggccagagcgugaccaucaccugcacaggguccagcagcgacguggggggcuacaacuacgugagcugguaccagcagcaccccggcaaggccccuaaggucgugaucuacgaggugaacaagcggcccuccggggucccccaccgguucuccgggagcaaguccgggaacaccgccagccugacagugagcgggcuccaggccgaggaugaggccgacuacuacugcuccagcuacgccggcaccgagacaguggccuucggcgggggcacuaagcugaccgugcugggccagccuaaggccgcccccuccgugacacuguucccacccuccagcgaggagcugcaggccaacaaggccacccuggugugccugaucuccgacuucuacccuggggccgugaccguggccuggaaggccgauagcagccccgugaaggccggcguggagacaacaacacccagcaagcagagcaacaacaaguacgccgccagcagcuaccugucccugacccccgagcaguggaagucccacaggagcuacagcugccaggucacccacgagggcagcacaguggaaaagacaguggcccccacagagugcagcuaagaauucuaggcuggagccucgguggccaugcuucuugccccuugggccuccccccagccccuccuccccuuccugcacccguacccccguggucuuugaauaaagucugagugggcggcacuaguan；

44、其中，an表示多聚腺苷酸序列(poly a)，n表示腺苷酸的数量；构建物a的核苷酸序列在序列表中如seq id no：1所示。

45、构建物a的核苷酸序列还可以选自与seq id no：1具有至少70％、至少80％或至少90％同源性的核苷酸序列。

46、优选构建物b的核苷酸序列为：

47、cuuguucuuuuugcagaagcucagaauaaacgcucaacuuuggcgccgccaccauggagcugggacugagcuggauuuuucugcuggccauucugaagggggugcagugccagguccagcugguccaaagcggcggcgggcucauucagcccggcgggucccugcggcucucuugugucgugagcggcuucaacguggccaccaacuacaugagcugggugaggcaggcccccggcaaggggcuggagugggugagcgugaucuacagcggcggcuccaccuacuacgccgacuccgugaaggggagguuuacuauuagccgggacaacagcaagaacacaguguuccugcagaugaacucccugcggcccgaggauacagccgccuacuacugcgccaagggcgggggccuggggcuggauuacugggggcagggcacccucgugaccgugagcagcgccagcaccaagggccccuccguguucccccuggcccccagcagcaaguccaccagcggcgggacagccgcccuggggugccuggugaaggauuacuuucccgagccagugacagugagcuggaacuccggggcccugacaagcggcgugcacacauuccccgccgugcuccaguccuccgggcucuacagccuguccuccgucgugaccgugccauccagcagccuggggacacagaccuacaucugcaacgugaaccacaagcccagcaacacaaagguggauaagcggguggagcccaaguccugcgauaagacacacacaugcccccccugccccgcccccgaggccgccggcgggccuagcguguuucuguucccccccaagcccaaggacacccuguacaucaccagggagcccgaggugaccugcguggugguggaugugagccacgaagauccugaggugaaguuuaacugguacguggacgggguggaggugcacaacgccaagaccaagcccagggaggagcaguacaacagcacauaccggguggugagcgugcugaccgugcugcaccaggacuggcugaacgggaaggaguacaagugcaaggugagcaacaaggcccuccccgcccccaucgagaaaaccaucuccaaggccaaggggcagccacgggagccccagguguacacccugcccccaagcagggaggagaugacaaagaaccaggugucccugacaugccuggugaagggguuuuaccccuccgacaucgccguggagugggagagcaacgggcagcccgagaacaacuacaagaccacccccccugugcuggacagcgacgggagcuucuuccuguacuccaagcugacagucgauaagagccgguggcagcagggcaacguguucagcugcagcgugaugcacgaggcccugcacaaccacuacacacagaagucccugagccucagcccagggaaguaagaauucuaggcuggagccucgguggccaugcuucuugccccuugggccuccccccagccccuccuccccuuccugcacccguacccccguggucuuugaauaaagucugagugggcggcacuaguan；

48、其中，an表示多聚腺苷酸序列(poly a)，n表示腺苷酸的数量；构建物b的核苷酸序列在序列表中如seq id no：2所示。

49、构建物b的核苷酸序列还可以选自与seq id no：2具有至少70％、至少80％或至少90％同源性的核苷酸序列。

50、一种本发明所述的编码m1r保护性抗体的mrna的应用，所述应用为所述mrna在制备抗正痘病毒感染的药物中的应用。

51、所述正痘病毒是指正痘病毒属病毒，优选为痘苗病毒、猴痘病毒、牛痘病毒和天花病毒中的至少一种。

52、所述抗正痘病毒感染的药物是指预防感染正痘病毒的药物，和/或感染正痘病毒后进行治疗的药物，所述药物可以以药物组合物或是试剂盒的形式出现。

53、一种药物组合物，包含本发明所述的一种编码m1r保护性抗体的mrna和递送载体，所述药物组合物作为抗正痘病毒感染的药物。

54、优选所述递送载体为纳米颗粒。

55、进一步地，优选所述递送载体为脂质纳米颗粒，如纳米脂球(lnp)。

56、更进一步地，优选所述脂质纳米颗粒具有50nm～200nm的平均直径，且具有小于0.4的多分散性系数值。

57、一种试剂盒，包含本发明所述的一种编码m1r保护性抗体的mrna和/或本发明所述的药物组合物，作为抗正痘病毒感染的药物。

58、有益效果

59、(1)本发明提供了一种编码m1r保护性抗体的mrna，所述mrna通过具有独创性的分子设计，通过合并频繁的密码子和/或具有更高trna丰度的密码子；富集鸟嘌呤-胞嘧啶含量提高体外的稳态mrna水平和体内的蛋白表达量；重点关注5’utr和3’utr的选择、信号肽的选择等mrna表达关键元件的设计，实现了在生物体内正确合成编码抗猴痘病毒imv表面蛋白m1r的单克隆抗体mab26。

60、(2)本发明提供了一种编码m1r保护性抗体的mrna的应用，所述的mrna接种balb/c小鼠后，可在小鼠体内产生具有中和活性的抗体，并且可以保护小鼠抵御正痘病毒感染，具备在制备抗正痘病毒感染的药物中的应用。

61、(3)本发明提供了一种编码m1r保护性抗体的mrna及其应用，本发明提供的mrna抗体与传统依赖哺乳动物细胞体外培养表达的蛋白抗体相比，具有颠覆性的优势。mrna抗体以机体自身细胞作为抗体生产的生物工厂，不仅能够产生自然状态下的抗体翻译后修饰，有效减少由抗体体外表达翻译异常修饰引起的异质性及抗体的错误折叠，并且能够有效地避免抗体复杂的体外生产及纯化过程。此外，mrna技术作为通用性技术平台，mrna抗体的制备工艺较传统蛋白更为简单、易实现快速及大规模标准化生产，并且便于储存和运输。

62、(4)本发明提供了一种药物组合物，通过将本发明所述的mrna和药学上可接受的载体结合，并选择脂质纳米颗粒进行包装递送，获得用于抗正痘病毒感染的信使核糖核酸(mrna)抗体。

63、(5)本发明提供了一种试剂盒，包含本发明所述的一种编码m1r保护性抗体的mrna和/或本发明所述的药物组合物，作为抗正痘病毒感染的药物制品，应用前景广阔。