一种用于靶向肿瘤微环境的信号感受器和用于靶向治疗肿瘤的细胞

本发明属于肿瘤免疫治疗，具体涉及一种用于靶向肿瘤微环境的信号感受器和用于靶向治疗肿瘤的细胞。

背景技术：

1、目前多种免疫细胞疗法已被运用于抗肿瘤治疗并取得一定疗效。从上世纪八十年代年运用淋巴因子激活的非特异性杀伤细胞(lymphokine-activated killer cells，lak)治疗黑色素瘤，到随后利用特定细胞因子激活的杀伤细胞(cytokine-induced killercells，cik)治疗b细胞淋巴瘤，随后，美国国立卫生研究院的rosenberg教授团队应用特异性更高的肿瘤浸润t细胞(tumor-infiltrating lymphocytes，til)进行过继抗肿瘤细胞治疗。近年来，基于基因工程技术改造的t细胞受体(t cell receptor，tcr)或嵌合抗原受体(chimericantigen receptor,car)t细胞免疫疗法成为肿瘤过继免疫治疗的热点，此外，nk细胞作为固有免疫系统的重要组成，能够比t细胞更快速、直接地发挥抗肿瘤作用，已有团队运用基因工程技术对nk细胞进行改造并用于抗肿瘤过继疗法。

2、vegfr是高度特异性的跨膜受体，在肿瘤新生血管内皮及部分肿瘤细胞膜高表达。vegfr家族主要包括三个酪氨酸激酶受体：vegfr-1、vegfr-2和vegfr-3。其配体，血管表皮生长因子(vegf)，是一种由细胞产生的刺激血管生成的信号转导蛋白，主要包括6种分泌型糖蛋白：vegf-a、vegf-b、vegf-c、vegf-d、vegf-e和胎盘生长因子(plgf)。vegf与受体(vascular endothelial growth factor receptor，vegfr)相互作用，引起信号级联反应，介导血管生成等生理或病理过程。

3、肿瘤微环境中，vegf-vegfr信号通路的存在的会导致免疫细胞过继疗法的效果下降。一方面，肿瘤及基质细胞表达的血管表皮生长因子(vascular endothelial growthfactor，vegf)及其受体等抑制性分子，产生免疫抑制微环境，可损伤回输的免疫细胞的抗肿瘤作用。另一方面，肿瘤微环境中的血管高表达vegfr1、vegfr2等分子，导致异常血管增生，免疫细胞进入肿瘤障碍以及肿瘤微环境乏氧，均可抑制免疫细胞抗肿瘤效果。

4、然而，当前尚无针对vegf-vegfr信号通路分子以优化改造免疫细胞的解决方案。本领域亟需发展新的免疫细胞或修饰免疫细胞的方法，使得免疫细胞克服上述vegf-vegfr信号通路的活性抑制现象，提升免疫细胞抗肿瘤活性，从而实现更好的抗肿瘤效果。

技术实现思路

1、针对现有技术的问题，本发明提供一种用于靶向肿瘤微环境的信号感受器和用于靶向治疗肿瘤的细胞，目的在于实现免疫细胞靶向vegf-vegfr信号通路并且在达到肿瘤微环境后激活的功能，为肿瘤的治疗提供新的临床用药选择。

2、一种用于靶向肿瘤微环境的信号感受器，它包括信号肽、胞外分子识别区、胞外铰链区、跨膜区和胞内共刺激信号区；

3、所述信号肽为与白介素2(interleukin 2，il-2)信号肽、白细胞分化抗原8(cd8)信号肽、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulatingfactor，gm-csf)信号肽或集落刺激因子2受体α亚基(colony stimulating factor2receptor subunit alpha,csf2ra)信号肽中序列同源性90％以上的蛋白结构域中的至少一种；

4、所述胞外分子识别区是与vegf或vegfr结合的单克隆抗体单链可变区、纳米单域抗体识别区、受体或配体中的至少一种；

5、所述胞外铰链区为与白细胞分化抗原8胞外铰链区、白细胞分化抗原28胞外铰链区、trail胞外铰链区、cd16胞外铰链区、nkp30胞外铰链区、nkg2c胞外铰链区、nkg2d胞外铰链区、2b4胞外铰链区或dnam-1胞外铰链区序列同源性90％以上的蛋白结构域中的至少一种；

6、所述跨膜区为与白细胞分化抗原8跨膜区、白细胞分化抗原28跨膜区、trail跨膜区、cd16跨膜区、nkp30跨膜区、nkg2c跨膜区、nkg2d跨膜区、2b4跨膜区或dnam-1跨膜区序列同源性90％以上的蛋白结构域中的至少一种；

7、所述胞内共刺激信号区为与白细胞分化抗原28、肿瘤坏死因子受体超家族成员4(tnfrsf4)、肿瘤坏死因子受体超家族成员9(tnfrsf9)、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(lck)、诱导性t细胞共刺激分子(icos)、cd40共刺激信号区、cd27共刺激信号区、dap10共刺激信号区、dap12共刺激信号区、trail共刺激信号区、cd16共刺激信号区、nkp30共刺激信号区、nkg2c共刺激信号区、nkg2d共刺激信号区、2b4共刺激信号区或dnam-1共刺激信号区序列同源性90％以上的蛋白结构域的胞内结构域中的至少一种。

8、优选的，所述vegf为vegf-a、vegf-b、vegf-c、vegf-d、vegf-e或胎盘生长因子中的至少一种；

9、所述vegfr为vegfr1、vegfr2或vegfr3中的至少一种。

10、优选的，它的组成按照如下任意一种方式选择：

11、组成方式一：

12、所述信号肽为集落刺激因子2受体α亚基信号肽，或经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的与集落刺激因子2受体α亚基信号肽功能相同或相似的肽；

13、所述胞外分子识别区为识别vegfr1的单克隆抗体单链可变区，或经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的与识别vegfr1的单克隆抗体单链可变区功能相同或相似的蛋白；

14、所述胞外铰链区为白细胞分化抗原28胞外铰链区，或经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的与白细胞分化抗原28胞外铰链区功能相同或相似的蛋白；

15、所述跨膜区为白细胞分化抗原28跨膜区，或经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的与白细胞分化抗原28跨膜区功能相同或相似的蛋白；

16、所述胞内共刺激信号区为白细胞分化抗原28的胞内结构域，或经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的与白细胞分化抗原28的胞内结构域功能相同或相似的蛋白；

17、组成方式二：

18、所述信号肽为白细胞分化抗原8信号肽，或经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的与白细胞分化抗原8信号肽功能相同或相似的肽；

19、所述胞外分子识别区为识别vegfr1的纳米单域抗体识别区，或经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的与识别vegfr1的纳米单域抗体识别区功能相同或相似的蛋白；

20、所述胞外铰链区为白细胞分化抗原8跨膜区，或经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的与白细胞分化抗原8胞外铰链区功能相同或相似的蛋白；

21、所述跨膜区为白细胞分化抗原8跨膜区，或经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的与白细胞分化抗原8跨膜区功能相同或相似的蛋白；

22、所述胞内共刺激信号区为4-1bb胞内共刺激信号区，或经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的与4-1bb胞内共刺激信号区功能相同或相似的蛋白；

23、组成方式三：

24、所述信号肽为白细胞分化抗原8信号肽，或经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的与白细胞分化抗原8信号肽功能相同或相似的肽；

25、所述胞外分子识别区为识别vegfr1的单克隆抗体单链可变区或纳米单域抗体识别区，或经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的与识别vegfr1的单克隆抗体单链可变区或纳米单域抗体识别区功能相同或相似的蛋白；

26、胞外铰链区为白细胞分化抗原8胞外铰链区，或经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的与白细胞分化抗原8胞外铰链区功能相同或相似的蛋白；

27、所述跨膜区为nkg2d跨膜区，或经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的与nkg2d跨膜区功能相同或相似的蛋白；

28、所述胞内共刺激信号区为nkg2d胞内共刺激信号区，或经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的与nkg2d胞内共刺激信号区功能相同或相似的蛋白。

29、组成方式四：

30、所述信号肽为集落刺激因子2受体α亚基信号肽，或经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的与集落刺激因子2受体α亚基信号肽功能相同或相似的肽；

31、所述胞外分子识别区为识别vegfr2的单克隆抗体单链可变区，或经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的与识别vegfr1的单克隆抗体单链可变区功能相同或相似的蛋白；

32、所述胞外铰链区为白细胞分化抗原28胞外铰链区，或经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的与白细胞分化抗原28胞外铰链区功能相同或相似的蛋白；

33、所述跨膜区为白细胞分化抗原28跨膜区，或经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的与白细胞分化抗原28跨膜区功能相同或相似的蛋白；

34、所述胞内共刺激信号区为白细胞分化抗原28的胞内结构域，或经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的与白细胞分化抗原28的胞内结构域功能相同或相似的蛋白；

35、组成方式五：

36、所述信号肽为集落刺激因子2受体α亚基信号肽，或经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的与集落刺激因子2受体α亚基信号肽功能相同或相似的肽；

37、所述胞外分子识别区为识别vegfr1的单克隆抗体单链可变区，或经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的与识别vegfr1的单克隆抗体单链可变区功能相同或相似的蛋白；

38、所述胞外铰链区为白细胞分化抗原8胞外铰链区，或经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的与白细胞分化抗原8胞外铰链区功能相同或相似的蛋白；

39、所述跨膜区为白细胞分化抗原8跨膜区，或经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的与白细胞分化抗原8跨膜区功能相同或相似的蛋白；

40、所述胞内共刺激信号区为4-1bb的胞内结构域，或经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的与4-1bb的胞内结构域功能相同或相似的蛋白。

41、优选的，所述集落刺激因子2受体α亚基信号肽的氨基酸序列如seq id no.1所示。

42、优选的，所述集落刺激因子2受体α亚基信号肽的编码核苷酸序列如seq id no.2所示。

43、优选的，所述识别vegfr1的单克隆抗体单链可变区的氨基酸序列如seq id no.3所示。

44、优选的，所述识别vegfr1的编码核苷酸序列如seq id no.4所示。

45、优选的，所述白细胞分化抗原28胞外铰链区的氨基酸序列如seq id no.5所示。

46、优选的，所述白细胞分化抗原28胞外铰链区的编码核苷酸序列如seq id no.6所示。

47、优选的，所述白细胞分化抗原28跨膜区的氨基酸序列如seq id no.7所示。

48、优选的，所述白细胞分化抗原28跨膜区的编码核苷酸序列如seq id no.8所示。

49、优选的，所述白细胞分化抗原28的胞内结构域的氨基酸序列如seq idno.9所示。

50、优选的，所述白细胞分化抗原28的胞内结构域的编码核苷酸序列如seq id no.10所示。

51、优选的，所述白细胞分化抗原8信号肽的氨基酸序列如seq id no.13所示。

52、优选的，所述白细胞分化抗原8信号肽的编码核苷酸序列如seq id no.14所示。

53、优选的，所述vegfr1的纳米单域抗体识别区的氨基酸序列如seq id no.15或seqid no.23所示。

54、优选的，所述vegfr1的纳米单域抗体识别区的编码核苷酸序列如seq id no.16或seq id no.24所示。

55、优选的，所述白细胞分化抗原8跨膜区的氨基酸序列如seq id no.17所示。

56、优选的，所述白细胞分化抗原8跨膜区的编码核苷酸序列如seq id no.18所示。

57、优选的，所述4-1bb胞内共刺激信号区的氨基酸序列如seq id no.19所示。

58、优选的，所述4-1bb胞内共刺激信号区的编码核苷酸序列如seq id no.20所示。

59、优选的，所述白细胞分化抗原8胞外铰链区的氨基酸序列如seq id no.27所示。

60、优选的，所述白细胞分化抗原8胞外铰链区的编码核苷酸序列如seq id no.28所示。

61、优选的，所述nkg2d跨膜区的氨基酸序列如seq id no.29所示。

62、优选的，所述nkg2d跨膜区的编码核苷酸序列如seq id no.30所示。

63、优选的，所述nkg2d胞内共刺激信号区的氨基酸序列如seq id no.31所示。

64、优选的，所述nkg2d胞内共刺激信号区的编码核苷酸序列如seq id no.32所示。

65、优选的，所述信号感受器的氨基酸序列如seq id no.11、seq id no.21、seq idno.25、seq id no.33、seq id no.34或seq id no.35所示。

66、优选的，所述信号感受器的编码核苷酸序列如seq id no.12、seq id no.22、seqid no.26、seq id no.36、seq id no.37或seq id no.38所示。

67、本发明还提供一种表达载体，它能够表达上述信号感受器。

68、优选的，它是重组质粒载体、重组病毒或它们的组合。

69、优选的，所述重组病毒为慢病毒载体或逆转录病毒载体。

70、本发明还提供一种用于靶向治疗肿瘤的细胞，它由上述表达载体和宿主细胞构成。

71、优选的，所述宿主细胞选自αβt细胞、nkt细胞或γδt细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、tcr修饰的t细胞、嵌合抗体受体t细胞或自然杀伤细胞。

72、本发明还提供一种用于治疗肿瘤的药物，它是以上述用于靶向治疗肿瘤的细胞作为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制成的。

73、优选的，所述肿瘤为肺癌、肝癌、淋巴瘤、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、多发性骨髓瘤或前列腺癌。

74、本发明中，术语“结构域”是指蛋白质中空间上可明显区分，又具有各自功能的区段；结构域中部分氨基酸残基的改变(替换、缺失和/或增加)并不会明显引起结构域功能的变化。因此应当知晓：本发明涉及的抗原受体，即使发生氨基酸残基改变，只要涉及的结构域功能无明显变化，均在本发明的范围内。

75、本发明提供一种人工构建的信号感受器及含有该信号感受器的宿主免疫细胞。该信号感受器可以特异性识别肿瘤微环境中的vegfr等免疫抑制性分子的一种或多种，将微环境中的抑制信号转换为免疫细胞内部的共刺激信号，参与活化免疫细胞，增强免疫细胞抗肿瘤活性。本发明在肿瘤的治疗中具有很好的应用前景。

76、显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

77、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。