一种利用发酵金针菇菇根制备丁香酸的方法

本发明涉及一种丁香酸的制备方法，具体为一种利用发酵金针菇菇根制备丁香酸的方法，属于微生物发酵应用领域。

背景技术：

1、丁香酸是蔬菜、水果等植物体内含量丰富的酚类化合物，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤和神经保护等作用，它在预防糖尿病、心血管疾病、癌症、脑缺血等方面具有应用潜力，被广泛应用于医药和化工等行业。传统的丁香酸制备及合成常以没食子酸或丁香醛为原料，通过氧化、水解等化学反应获得，但往往具有价格高、副产物较多、纯度差等特点。

2、木质素是植物细胞壁的主要成分之一，主要由苯丙烷基团通过醚键或碳键连接而成的含酚的高分子聚合物，含有丰富的丁香醛化合物，为丁香酸的获得提供了可持续的原料。目前，从植物基质中提取结合态多酚的主要方法包括化学水解(酸、碱水解)和物理辅助水解(微波、超声)等，通过破坏酚类化合物与细胞壁连接的醚键、酯键或糖苷键，释放酚类化合物，但也存在反应时间长、易降解等特点。金针菇富含丰富的维生素、多糖、粗纤维和木质素等成分，具有抗氧化、免疫调节和降低胆固醇等多种生物学功能。金针菇企业生产过程中会产生大量的副产物如菇根、菌糠等，如何实现金针菇废弃物的资源化利用，也是食品生产企业亟需解决的重要问题。

3、微生物发酵是一种传统的生物工艺，在食品工业中因其可改善口感、增加营养和功能性成分，减少抗营养物质而受到广泛关注。微生物产生的水解酶可破坏细胞壁和糖苷类物质，释放和转化酚类化合物，具有反应温和、低成本、效率高、低污染等优点。此外，与单菌种发酵相比较，微生物共培养和联合发酵能有效增加酚类物质含量及其生物利用性。然而目前还没有通过微生物联合发酵金针菇菇根产生酚酸类物质如丁香酸的专利。

技术实现思路

1、本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种利用发酵金针菇菇根制备丁香酸的方法。

2、本发明通过以下技术方案来实现上述目的，一种利用发酵金针菇菇根制备丁香酸的方法，包括以下步骤：

3、①菌种活化和培养

4、从液氮中分别取出装有枯草芽孢杆菌cmccb 63501、酵母菌atcc 9763以及嗜酸乳杆菌cgmcc 1.12735的保存管，置于37℃的水浴中，轻轻摇动1-2min，至冰完全溶解，在无菌操作台上，用灭菌金属环蘸取菌液，以划线法接种于培养基，待菌液吸收完全后，将接种好的培养基倒置放于培养箱中进行培养1-2d后，用接种环挑取典型菌落，接种在平板培养基中，继代划线3次，长出菌落后，挑取长势良好的单克隆菌落接种于液体培养基中培养，作为种子液；

5、采用tsb液体培养基培养枯草芽孢杆菌cmccb 63501，培养条件为：35℃恒温培养28h，4000r/min离心15min后收集菌体，利用0.01m pbs缓冲液清洗两次后重悬，调整菌株悬液浓度约为109cfu/ml；

6、采用ypd液体培养基培养酵母菌atcc 9763，培养条件为：35℃恒温培养28h，4000r/min离心15min后收集菌体，利用0.01m pbs缓冲液清洗两次后重悬，调整菌株悬液浓度约为108cfu/ml；

7、采用mrs液体培养基培养嗜酸乳杆菌cgmcc 1.12735，培养条件为：35℃恒温培养28h，4000r/min离心15min后收集菌体，利用0.01m pbs缓冲液清洗两次后重悬，调整菌株悬液浓度约为109cfu/ml；

8、②金针菇菇根处理

9、将金针菇菇根通过粉碎机粉碎后，通过0.75mm筛子，粉碎后的菇根使用高压锅蒸汽灭菌，条件为100kpa压力下，温度120℃灭菌20min；

10、③最优发酵条件的选择

11、先采用最陡爬坡试验确定发酵的最佳混合发酵时间、菌种接种量以及含水量，试验结果表明，在混合发酵时间为36h、菌种接种量为1.25％、含水量为40％时，发酵后产生的丁香酸含量最高；

12、再依据最陡爬坡试验，选择混合发酵时间(a)、菌液接种量(b)、发酵物含水量(c)为3个因素，以丁香酸含量为响应值设计box-behnken试验，对实验结果进行多元回归分析，得到二次回归方程模型：

13、y＝22.63-0.351*a-0.601*b+0.930*c-2.069*a2-2.894*b2-3.542*c2-

14、0.285*ab-1.203*ac-0.888*bc；

15、绘制响应曲面，并最终确定最优发酵条件为混合发酵时间为38h、混菌接菌量1.25％、水分含量40％；

16、④发酵制备丁香酸

17、将枯草芽孢杆菌cmccb 63501的菌液按照1：80比例与粉碎灭菌后的金针菇菇根混合，混合均匀后补充无菌水，控制水分在40％，37℃发酵72h，再将酵母菌atcc 9763和嗜酸乳杆菌cgmcc 1.12735的菌种分别按照同样比例加入枯草芽孢杆菌cmccb 63501与金针菇菇根的发酵液中，继续30℃发酵38h，测定活菌数≥5.0*109cfu/l的发酵液，即为金针菇菇根复合发酵菌液；

18、⑤检测金针菇菇根复合发酵菌液中的丁香酸

19、采用高效液相色谱法对金针菇菇根复合发酵菌液进行分析，结果表明，与发酵前相比较，发酵后的金针菇菇根复合发酵菌液中丁香酸含量显著升高，丁香酸从0％增加至22.22％；

20、⑤金针菇菇根复合发酵菌液氧化应激分析

21、试验设计如下：

22、试验选取40只4周龄、体重18-22g的balb/c雄性小鼠，随机分为4组，每组10只，分为对照组、模型组、发酵前组和发酵后组，对照组和模型组饲喂基础日粮，发酵前组在饲喂基础日粮基础上每天灌胃2ml发酵前溶液(按50mg/kg体重灌胃量计算)；发酵后组在饲喂基础日粮基础上每天灌胃2ml发酵后溶液(按50mg/kg体重灌胃量计算)；试验周期为60天，饲喂59天后，在最后一天模型组、发酵前组和发酵后组腹腔注射2ml、浓度为3mg/kg脂多糖(lps)，对照组注射等体积生理盐水，试验结束后采集血清测定氧化应激指标。

23、优选地，所述tsb液体培养基中，每升培养基含胰酪蛋白胨15g，大豆蛋白胨5.0g，nacl 5.0g，ph 7.3；所述ypd液体培养基中，每升培养基含葡萄糖20g，酵母粉5g，蛋白胨10g；所述mrs液体培养基中，每升培养基含蛋白胨10.0g、牛肉粉5.0g、酵母粉4.0g、葡萄糖20.0g、吐温80 1.0ml、k2hpo4·7h2o 2.0g、ch3coona·3h2o 5.0g、柠檬酸铵2.0g、mgso4·7h2o 0.2g、mnso4·4h2o 0.05g。

24、优选地，所述balb/c雄性小鼠购自，所有小鼠均在25±2℃、相对湿度55±5％、光照/黑暗循环12h的标准条件下饲养，自由饮水。

25、优选地，所述鼠基础饲粮购自于江苏省协同医药生物工程有限责任公司，饲料型号为d12492j。

26、本发明的有益效果是：本发明公开的一种利用发酵金针菇菇根制备丁香酸的方法，通过益生菌发酵对金针菇菇根成分进行生物转化，提高其生物学利用率，增加酚酸类物质如丁香酸的含量，在体内外证实相比较于发酵前，发酵后具有更好的自由基清除能力和抗氧化能力。