用于检测鼠疫耶尔森菌的抗LcrV抗体及其应用的制作方法

本发明属于诊断用抗体制备，包括用于检测鼠疫耶尔森菌的抗lcrv抗体及其应用，具体包括一种抗lcrv抗体rv-e8、鼠疫耶尔森菌诊断试剂、鼠疫耶尔森菌诊断产品以及相关方法和应用。

背景技术：

1、鼠疫是我国传染病防治法规定的甲类传染病，其病原体为鼠疫耶尔森菌(yersinia pestis)。鼠疫依发病部位不同可分为腺鼠疫、败血型鼠疫、肺鼠疫、肠鼠疫、脑膜炎型鼠疫、眼鼠疫、皮肤鼠疫等，其中以腺鼠疫最为常见。鼠疫的主要传播途径包括：(1)蚤类叮咬，鼠疫的最主要传染源是啮齿类动物，鼠疫耶尔森菌可通过蚤类叮咬传染给人类和其他动物。鼠疫耶尔森菌经皮肤进入人体，沿淋巴循环和血循环扩散，引起腺体坏死和败血症，即腺鼠疫和败血型鼠疫；(2)接触传播，鼠疫耶尔森菌可以通过伤口进入人体，然后经淋巴管或血液引起腺鼠疫或败血型鼠疫；(3)飞沫传播，鼠疫耶尔森菌可经呼吸、咳嗽飞沫进行传播，吸入一定数量的鼠疫耶尔森菌后，可引起肺鼠疫；(4)食物传播，鼠疫耶尔森菌可通过食物感染消化道，引发肠鼠疫。

2、虽然现在并非处于鼠疫大流行的时期，但是鼠疫仍然呈高度散发状态。21世纪以来，在亚洲、非洲和美洲均有报道，目前乌干达、刚果以及马达加斯加岛是主要的疫源地。根据who统计，2013-2018年全球共报告了2886例鼠疫，其中死亡504例。已研究发现的鼠疫耶尔森菌中主要抗原成分或毒力因子有f1(荚膜抗原)、lcr(低钙反应蛋白，包括lcrg、lcrv、lcrh等)、yops(耶尔森氏菌外膜蛋白)、pgm(色素沉着)、pst1(鼠疫菌素1)和ph6等。对鼠疫耶尔森菌免疫原性起决定作用的是两种主要成分：一个是鼠疫耶尔森菌的荚膜蛋白抗原(f1抗原)，另一个是鼠疫耶尔森菌保护性抗原(v抗原)。其中，编码v抗原的lcrv基因全长981bp，编码326个氨基酸，v抗原是一个具有双重功能的蛋白，其分子质量为36kda，既具有调节生长和低钙反应毒力基因的表达作用，又是一种毒力蛋白。针对lcrv抗原的单克隆抗体具有开发成鼠疫耶尔森菌诊断制剂的潜力。

3、目前，本领域仍然亟需能够用于鼠疫耶尔森菌诊断制剂开发的候选抗体。

技术实现思路

1、针对上述现有技术中本领域存在的不足，本发明的目的在于提供用于检测鼠疫耶尔森菌的抗lcrv抗体rv-e8及其相关衍生产品和应用，所述抗体rv-e8对lcrv具有较高的特异性和亲和力，能够用于鼠疫耶尔森菌感染的早期诊断和筛查中，为本领域开发鼠疫耶尔森菌感染相关的早期检测和筛查工具奠定了基础。本发明采用了如下技术方案实现上述发明目的：

2、针对鼠疫耶尔森菌lcrv抗原的抗体

3、在一方面，本发明提供了一种针对鼠疫耶尔森菌lcrv抗原的抗体。

4、进一步，所述抗体包含重链可变区中的三个重链互补决定区(hcdr1、hcdr2和hcdr3)和轻链可变区中的三个轻链互补决定区(lcdr1、lcdr2和lcdr3)；

5、所述hcdr1、hcdr2和hcdr3的氨基酸序列分别如seq id no:1、seq id no:2和seqid no:3所示；

6、所述lcdr1、lcdr2和lcdr3的氨基酸序列分别如seq id no:4、seq id no:5和seqid no:6所示。

7、进一步，所述抗体包含：

8、(i)如seq id no:7所示的重链可变区或与seq id no:7所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的重链可变区；

9、(ii)如seq id no:8所示的轻链可变区或与seq id no:8所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的轻链可变区。

10、在一些实施方案中，在不实质性影响所述抗体活性的前提下，本领域技术人员可以对本发明所述的抗体对应的序列改变一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸，以获得所述抗体或其功能性片段序列的变体。这些变体包括但并不限于：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质的功能。如在可变区的fr和/或cdr区中将具有类似性质的氨基酸进行取代。可进行保守性取代的氨基酸残基为本领域所公知的。这样取代的氨基酸残基可以是、也可以不是由遗传密码编码的。又比如，在c末端和/或n末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。

11、在某一具体实施方案中，本发明所述的各种抗体的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明提供的抗体的编码dna杂交的dna所编码的蛋白、以及利用抗本发明提供的抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。此外，所述功能性变异体还包括在一级结构序列中基本类似、但包括本发明的亲本抗体中没有的，例如体外或体内的化学和/或生物化学改性的衍生物。这些改性包括例如乙酰化、酰化、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、交联、二硫键的形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解处理、磷酸化，这样的功能性变异体同样包含在本发明的保护范围内。

12、在一些实施方案中，本发明所述hcdr1-3、lcdr1-3对应的氨基酸序列并不局限于如本发明第一方面中所述的hcdr1-3、lcdr1-3对应的氨基酸序列，采用任何cdr编号方案(现有的cdr编号方案或将来产生的新的cdr编号方案)对如seq id no:7所示的重链可变区中的hcdr1-3、如seq id no:8所示的轻链可变区中的lcdr1-3进行定义得到的hcdr1-3、lcdr1-3对应的氨基酸序列或核苷酸序列均在本发明的保护范围内，由这些cdrs构成的抗体同样落入本发明的保护范围。

13、在优选的实施方案中，所述hcdr1-3、lcdr1-3是根据imgt编号方案、chothia编号方案、kabat编号方案、martin(增强型chothia)编号方案、abm编号方案、aho编号方案、contact编号方案中的任意一种定义或任意多种(两种或两种以上)组合定义得到的，经上述定义方式定义得到的hcdr1-3、lcdr1-3对应的抗体序列同样包含在本发明的保护范围内。

14、多核苷酸分子

15、在另一方面，本发明提供了一种编码本发明第一方面所述抗体的分离的多核苷酸分子；

16、优选地，所述多核苷酸分子编码本发明第一方面所述的抗体、本发明第一方面所述抗体的重链可变区或本发明第一方面所述抗体的轻链可变区；

17、更优选地，编码本发明第一方面所述抗体的重链可变区的多核苷酸分子的序列如seq id no:9所示；

18、更优选地，编码本发明第一方面所述抗体的轻链可变区的多核苷酸分子的序列如seq id no:10所示。

19、在一些实施方案中，本发明所述的多核苷酸分子可以通过以下方法合成：(i)在体外扩增，例如通过聚合酶链式反应(pcr)扩增产生的；(ii)通过克隆重组产生；(iii)纯化，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离；或者(iv)合成，例如通过化学合成。

20、在某一具体实施方案中，所述分离的多核苷酸分子是通过重组dna技术制备得到的核酸分子。在本发明中，可以通过本领域已知的多种方法来制备编码本发明第一方面所述抗体的核酸，这些方法包括但不限于：采用限制性片段操作或采用合成性寡核苷酸的重叠延伸pcr。

21、表达载体

22、在另一方面，本发明提供了一种包含本发明第二方面所述多核苷酸分子的表达载体；

23、优选地，所述载体包括质粒、病毒来源的载体；

24、更优选地，所述病毒来源的载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体。

25、在本发明中，所述包含本发明第二方面所述多核苷酸分子的载体可以是表达载体、整合载体或克隆载体。通常通过可操作地连接本发明第二方面所述的多核苷酸分子序列至表达载体，以实现本发明第二方面所述的多核苷酸分子序列的表达。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。整合载体含有将靶序列整合到细胞基因组上的组件。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。载体通常含有用于质粒维系和用于克隆与表达外源性核苷酸序列的序列。所述序列通常包括一个或多个以下核苷酸序列：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完全内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码将要表达的单克隆抗体的核酸的多连接子区和可选标记元件。

26、重组宿主细胞

27、在另一方面，本发明提供了一种包含本发明第三方面所述表达载体的重组宿主细胞；

28、优选地，所述宿主细胞包括真核细胞或原核细胞；

29、更优选地，所述宿主细胞为真核细胞；

30、最优选地，所述真核细胞为哺乳动物细胞。

31、在一些实施方案中，能够用作表达本发明第一方面所述抗体的宿主细胞是本领域所公知的，并且许多宿主细胞可从美国典型培养物保藏中心(american type culturecollection，atcc)获得。这些宿主细胞尤其包含中国仓鼠卵巢(cho)细胞、ns0、sp2细胞、海拉细胞(hela cell)、小仓鼠肾(bhk)细胞、猴肾细胞(cos)、人肝细胞癌细胞(例如，hepg2)、a549细胞、3t3细胞、hek-293细胞和许多其它多种类型的细胞系。

32、生产方法

33、在另一方面，本发明提供了一种生产本发明第一方面所述抗体的方法。

34、进一步，所述方法包括如下步骤：

35、(i)培养本发明第四方面所述的重组宿主细胞，获得含有抗体的培养物；

36、(ii)从步骤(i)获得的培养物中分离或回收得到本发明第一方面所述的抗体。

37、制备方法

38、在另一方面，本发明提供了一种制备本发明第四方面所述重组宿主细胞的方法。

39、进一步，所述方法包括如下步骤：将本发明第三方面所述的表达载体引入到宿主细胞中，得到本发明第四方面所述的重组宿主细胞；

40、优选地，所述引入的方法包括微注射、电穿孔、脂质转染法、dna载体、rna载体；

41、优选地，所述宿主细胞包括真核细胞或原核细胞；

42、更优选地，所述宿主细胞为真核细胞；

43、最优选地，所述真核细胞为哺乳动物细胞。

44、检测方法

45、在另一方面，本发明提供了一种基于非诊断目的地检测lcrv蛋白的方法。

46、进一步，所述方法包括如下步骤：

47、(i)将待测样品与本发明第一方面所述的抗体接触；

48、(ii)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中，形成抗原-抗体复合物则表明待测样品中存在lcrv蛋白。

49、在一些实施方案中，所述待测样品选自受试者来源的体液、排泄物、细胞；例如血清、血浆、全血、淋巴液、脑脊液、组织液、唾液、尿液、淋巴细胞等，但不限于此。在另外一些实施方案中，所述待测样品包括食品样品、环境样品。

50、如下任一种物质

51、在另一方面，本发明提供了如下任一种物质：

52、(1)一种免疫偶联物，所述免疫偶联物包含本发明第一方面所述的抗体和与其偶联的偶联物；

53、优选地，所述偶联物包括化学发光剂、生物发光剂、光敏诊断剂、放射性核素、顺磁性离子、酶；

54、更优选地，所述化学发光剂包括鲁米诺、异鲁米诺、芳族吖啶酯、咪唑、吖啶盐、草酸酯；

55、更优选地，所述生物发光剂包括荧光素、荧光素酶、水母发光蛋白；

56、更优选地，所述光敏诊断剂包括二羟基硅酞菁、亚甲基蓝、原卟啉、血卟啉、光卟啉；

57、更优选地，所述放射性核素包括18f、52fe、62cu、64cu、67cu、86y、90y、89zr、120i、123i、124i、125i、131i、13n、15o、186re；

58、更优选地，所述顺磁性离子包括铁(iii)、铁(ii)、钴(ii)、铬(iii)、锰(ii)、镍(ii)、铜(ii)、镱(iii)、钕(iii)、钐(iii)、钆(iii)、钒(ii)；

59、更优选地，所述酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β-d-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶；

60、(2)一种检测剂，所述检测剂包含本发明第一方面所述的抗体、本发明第四方面所述的重组宿主细胞和/或所述免疫偶联物；

61、(3)一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包含本发明第一方面所述的抗体、本发明第四方面所述的重组宿主细胞、所述免疫偶联物和/或所述检测剂；

62、(4)一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的本发明第一方面所述的抗体。

63、在一些实施方案中，所述药物组合物还包含药学或生理学上可接受的载体和/或辅料，所述载体和/或辅料可以包含无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)nacl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、ringer氏溶液及其任意组合。

64、在本发明中，所述有效量是指引发例如研究者或临床医师所追求的组织、系统、动物或人的生物学或药学响应的药物或药剂的量。此外，治疗有效量表示与没有接受该量的相应受试者相比，引起疾病、病症或副作用的改进治疗、治愈、预防或减轻的量，或者使疾病或病况的进展速率降低的量。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的量。通常，本文中的有效量根据各种因素而变化，所述因素例如给定的药物或化合物、药学制剂、给药途径、疾病或病症的类型、被治疗的受试者等等，但仍然可以由本领域技术人员常规地确定。本发明第一方面所述抗体的治疗有效量可以由本领域技术人员通过本领域已知的常规方法容易地确定。

65、如下任一方面应用

66、在另一方面，本发明提供了如下任一方面应用：

67、(1)本发明第一方面所述的抗体、本发明第二方面所述的多核苷酸分子、本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的重组宿主细胞、本发明第八方面中所述的免疫偶联物、检测剂和/或检测试剂盒在非诊断目的地用于检测鼠疫耶尔森菌lcrv蛋白中的应用；

68、(2)本发明第一方面所述的抗体、本发明第二方面所述的多核苷酸分子、本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的重组宿主细胞、本发明第八方面中所述的免疫偶联物、检测剂和/或检测试剂盒在制备用于检测鼠疫耶尔森菌的产品中的应用；

69、(3)本发明第一方面所述的抗体、本发明第二方面所述的多核苷酸分子、本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的重组宿主细胞、本发明第八方面中所述的免疫偶联物、检测剂和/或检测试剂盒在制备用于诊断鼠疫耶尔森菌感染性疾病的产品中的应用；

70、(4)本发明第一方面所述的抗体、本发明第二方面所述的多核苷酸分子、本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的重组宿主细胞在制备用于治疗鼠疫耶尔森菌感染性疾病的药物中的应用。

71、诊断方法

72、在另一方面，本发明提供了一种诊断和/或辅助诊断鼠疫耶尔森菌感染性疾病的方法，所述方法包括如下步骤：采用本发明第一方面所述的抗体、本发明第四方面所述的重组宿主细胞、本发明第八方面中所述的免疫偶联物、检测剂和/或检测试剂盒对受试者来源的待测样品进行检测，通过抗原抗体反应来检测待测样品中鼠疫耶尔森菌v蛋白的水平。

73、进一步，本发明第一方面所述的抗体、本发明第二方面所述的多核苷酸分子、本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的重组宿主细胞、本发明第八方面中所述的免疫偶联物、检测剂和/或检测试剂盒可用于诊断目的，用来检测、诊断或监控鼠疫耶尔森菌感染性疾病的发展情况。可采用本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法检测待测样品中鼠疫耶尔森菌v蛋白的存在。可以体内或体外进行鼠疫耶尔森菌v蛋白的检测。适用于检测鼠疫耶尔森菌v蛋白存在与否的方法的实例包括但不限于：elisa、facs、ria等。

74、治疗方法

75、在另一方面，本发明提供了一种治疗和/或预防鼠疫耶尔森菌感染性疾病的方法，所述方法包括如下步骤：给有需要的受试者施用治疗有效量的本发明第一方面所述的抗体或本发明第八方面中所述的药物组合物。