一种特异性结合鼠疫耶尔森菌V抗原的全人源单克隆抗体的制作方法

本发明属于鼠疫诊断，涉及一种特异性结合鼠疫耶尔森菌v抗原的全人源单克隆抗体，具体涉及一种特异性结合鼠疫耶尔森菌v抗原的全人源单克隆抗体rv-d1及其相关产品和应用。

背景技术：

1、鼠疫(plague)是指由鼠疫耶尔森菌(yersinia pestis)引起的自然疫源性疾病。通过鼠蚤媒介，经人的皮肤传入引起腺鼠疫，经呼吸道传入发生肺鼠疫。临床表现为发热、淋巴结肿大、肺炎、出血倾向。可发展为败血症，传染性强，死亡率高，是危害人类最严重的烈性传染病之一。鼠疫属国际检疫传染病和我国法定的甲类管理传染病。鼠疫的发生和流行直接关系到人群健康。因此，无论是预防还是治疗，都需要开发一种快速、灵敏和特异的方法来检测鼠疫耶尔森菌。经典的鼠疫耶尔森菌检测方法包括分离培养、pcr技术、全基因组和宏基因组测序等等，这些方法虽然在检测鼠疫耶尔森氏菌方面起着重要作用，但同时具有费时费力、时间周期长且效率低、需要专业人员及昂贵仪器、假阳性率高、不适于临场快速检测等问题。目前，本领域仍需要开发一种简单、快速和有效的鼠疫耶尔森菌检测方法。

2、鼠疫耶尔森菌v抗原，又称低钙反应蛋白v抗原(low-calcium response vantigen，lcrv)，是由鼠疫耶尔森菌合成并分泌的一种多功能的重要毒力因子，同时也是鼠疫耶尔森菌主要的保护性抗原，研究发现v抗原可以保护多种实验动物抵抗鼠疫耶尔森菌攻击，v抗原产生的免疫保护被特异性抗体所介导，抗v抗原的多抗血清或其单克隆抗体可以被动保护实验动物抵抗鼠疫耶尔森菌攻击。v抗原构成了ⅲ型分泌系统注射体的针尖，调控ⅲ型分泌系统的分泌，直接产生抗炎症作用，因而在鼠疫菌的感染与免疫中发挥着重要作用。v抗原由326个氨基酸组成，分子量为37kda，晶体结构包括12个α螺旋和6个β折叠，形成哑铃状结构。研究对鼠疫耶尔森菌v抗原具有较好亲和力和特异性的单克隆抗体将会进一步促进鼠疫耶尔森菌感染疾病相关的快速诊断试剂的开发。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于：为本领域提供一种能够特异性结合鼠疫耶尔森菌v抗原的全人源单克隆抗体，所述单克隆抗体为rv-d1，所述rv-d1的重链可变区中的hcdr1-3的氨基酸序列分别如seq id no:1-3所示，轻链可变区中的lcdr1-3的氨基酸序列分别如seq id no:4-6所示，其能够特异性识别鼠疫耶尔森菌v抗原，并且具有非常高的特异性和亲和力，在鼠疫耶尔森菌相关检测产品的开发和应用这一技术领域具有重要的应用前景，基于此，发明人提出了本发明。本发明所要解决的以上技术问题采用以下技术方案来实现：

2、在一方面，本发明提供了一种特异性结合鼠疫耶尔森菌v抗原的抗体或其抗原结合片段。

3、进一步，所述抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列如seq id no:7所示的重链可变区中的hcdr1-3、氨基酸序列如seq id no:8所示的轻链可变区中的lcdr1-3。

4、进一步，所述hcdr1-3的氨基酸序列分别如seq id no:1-3所示，所述lcdr1-3的氨基酸序列分别如seq id no:4-6所示；

5、优选地，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:7所示；

6、优选地，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:8所示。

7、进一步，与本发明提供的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2、lcdr3对应的氨基酸序列具有70％以上同源性的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2、lcdr3对应的抗体同样包含在本发明的保护范围内。

8、在本发明中，对所述hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2、lcdr3的具体序列并无特别限制，只要是基于如seq id no:7所示的重链可变区、如seq id no:8所示的轻链可变区结合任何cdr编号方案(现有的cdr编号方案或将来产生的新的cdr编号方案)进行定义得到的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2、lcdr3对应的抗体的氨基酸序列或核苷酸序列均在本发明的保护范围内。

9、在一些实施方案中，所述cdr编号方案包括但不限于：imgt编号方案、chothia编号方案、kabat编号方案、martin(增强型chothia)编号方案、abm编号方案、aho编号方案、contact编号方案中的任意一种定义或任意多种(两种或两种以上)组合，采用上述定义方式对如seq id no:7所示的重链可变区、如seq id no:8所示的轻链可变区进行定义得到的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2、lcdr3对应的抗体均落入本发明的保护范围。

10、此外，本发明还提供了一种双特异性抗体或其抗原结合片段。

11、进一步，所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含本发明第一方面所述的特异性结合鼠疫耶尔森菌v抗原的抗体或其抗原结合片段，以及与所述抗体或其抗原结合片段功能性连接的具有另一种抗原结合特性的抗体或其抗原结合片段。

12、在本发明中，对所述功能性连接的方式并无特别限制，所述功能性连接的方式包括但不限于：通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其它方式连接。

13、在另一方面，本发明提供了一种核酸分子。

14、进一步，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区或本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区；

15、优选地，编码本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的核酸分子的核苷酸序列如seq id no:9所示；

16、优选地，编码本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的核酸分子的核苷酸序列如seq id no:10所示。

17、在一些实施方案中，可以使用标准分子生物学技术来获得本发明所述的核酸分子。一旦获得编码vh区段的dna片段，进一步通过标准重组dna技术操作这些dna片段，以例如将可变区基因转变为全长抗体链基因、或抗原结合片段dna片段。在这些操作中，将编码vh的dna片段可操作的连接至编码另一蛋白质，诸如抗体恒定区或柔性接头的另一dna片段。

18、在一些实施方案中，本发明所述的核酸分子优选为分离的核酸分子，其中，分离的是指已经从其产生环境(例如，天然的或重组的)的组分中识别、分离和/或回收的核酸分子。其产生环境的污染组分通常是干扰其研究、诊断或治疗用途的物质，可以包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。分离的核酸分子通常将通过至少一个纯化步骤来制备。

19、在另一方面，本发明提供了一种表达载体。

20、进一步，所述表达载体包含本发明第二方面所述的核酸分子；

21、优选地，所述表达载体中的核酸分子与启动子可操作性地连接；

22、更优选地，所述启动子包括tac启动子、sv40启动子、cmv启动子、lac启动子、plλ启动子、rac5启动子、sp6启动子、amp启动子、reca启动子、trp启动子、t7启动子、mmtv启动子；

23、更优选地，所述载体包括质粒载体、粘粒载体、病毒载体；

24、最优选地，所述病毒载体包括噬菌体载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体。

25、在本发明中，所述表达载体是指用于表达例如编码所需多肽(例如抗体)的多核苷酸的dna结构。重组表达载体可包括，例如包含(i)对基因表达具有调控作用的遗传元素的集合，例如启动子和增强子；(ii)转录成mrna并翻译成蛋白质的结构或编码序列；以及(iii)适当的转录和翻译起始和终止序列的转录亚单位。本发明所述的表达载体可以任何合适的方式构建，并可以使用任何载体，包括但不限于：质粒、病毒、噬菌体和转座子。

26、在一些实施方案中，用于本发明的可能的载体包括但不限于：染色体、非染色体和合成dna序列，例如病毒质粒、细菌质粒、噬菌体dna、酵母质粒以及从质粒和噬菌体dna的组合中衍生的载体，来自如慢病毒、逆转录病毒、牛痘、腺病毒、鸡痘、杆状病毒、sv40和伪狂犬病等病毒的dna。

27、在另一方面，本发明提供了一种基因改造的宿主细胞。

28、进一步，所述基因改造的宿主细胞包含本发明第三方面所述的表达载体或其基因组中整合有本发明第二方面所述的核酸分子；

29、优选地，所述宿主细胞包括真核细胞、原核细胞；

30、更优选地，所述宿主细胞为真核细胞；

31、最优选地，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、植物细胞、真菌细胞、真核藻类细胞、昆虫细胞、原生动物细胞、鱼类细胞。

32、在本发明中，对宿主细胞的类型并无特别限制，适用于本发明的宿主细胞包括但不限于：大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如s2果蝇细胞或sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，cho细胞、cos细胞、nso细胞、hela细胞、bhk细胞、hek293细胞或人细胞等的动物细胞。在本发明中的一些实施方案中，所述宿主细胞优选为真核细胞，更优选为哺乳动物细胞。

33、在另一方面，本发明提供了一种用于检测鼠疫耶尔森菌的检测试剂。

34、进一步，所述检测试剂包含本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。

35、在另一方面，本发明提供了一种用于检测鼠疫耶尔森菌的检测产品。

36、进一步，所述检测产品包含本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段或本发明第五方面所述的检测试剂；

37、优选地，所述检测产品包括试剂盒；

38、更优选地，所述试剂盒包括酶联免疫试剂盒、胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、荧光免疫试剂盒、放射免疫试剂盒。

39、在一些实施方案中，所述试剂盒中还包括固相载体，本发明提供的抗体或其抗原结合片段被固定于固相载体(例如多孔板、盖玻片、微珠)或游离存在。所述试剂盒中还包括：能与所述抗体或其抗原结合片段连接的可检测部分，可检测部分可分离地存在于试剂盒中；和/或与可检测部分相对应的底物；和/或酶联免疫反应试剂，所述反应试剂包括但不限于：包被(缓冲)液，洗涤(缓冲)液，封闭液，固定液，终止液，显色液；和/或说明检测鼠疫耶尔森菌v蛋白方法的使用说明书。

40、在另一方面，本发明提供了一种药物组合物。

41、进一步，所述药物组合物包含本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。

42、在另一方面，本发明提供了如下任一种方法：

43、(1)一种如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段的制备方法，所述制备方法包括：培养本发明第四方面所述的基因改造的宿主细胞，得到宿主细胞培养物，从培养物中分离得到本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段；

44、(2)一种体外非诊断性地检测鼠疫耶尔森菌v蛋白的方法，所述方法包括：采用本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、本发明第五方面所述的检测试剂对待测样本进行检测，从而获得待测样本中v蛋白的定性或定量检测结果；

45、(3)一种体外特异性抑制鼠疫耶尔森菌v蛋白活性的方法，所述方法包括：将本发明第二方面所述的核酸分子引入到生物体细胞中，通过表达本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段抑制v蛋白活性。

46、此外，本发明还提供了一种诊断和/或辅助诊断鼠疫耶尔森菌感染性疾病的方法。

47、进一步，所述方法包括如下步骤：采用本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、本发明第五方面所述的检测试剂和/或本发明第六方面所述的检测产品对受试者来源的待测样品进行检测，检测待测样品中鼠疫耶尔森菌lcrv蛋白的存在情况。

48、此外，本发明还提供了一种治疗鼠疫耶尔森菌感染性疾病的方法。

49、进一步，所述方法包括如下步骤：给有需要的受试者施用治疗有效量的本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段或本发明第七方面所述的药物组合物。

50、在另一方面，本发明提供了如下任一方面应用：

51、(1)本发明第四方面所述的基因改造的宿主细胞在制备本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段中的应用；

52、(2)本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的基因改造的宿主细胞、本发明第五方面所述的检测试剂和/或本发明第六方面所述的检测产品在非诊断性地检测鼠疫耶尔森菌v蛋白中的应用；

53、(3)本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的基因改造的宿主细胞、本发明第五方面所述的检测试剂和/或本发明第六方面所述的检测产品在制备用于诊断和/或辅助诊断鼠疫耶尔森菌感染性疾病的诊断产品中的应用；

54、(4)本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的表达载体和/或本发明第四方面所述的基因改造的宿主细胞在制备用于检测鼠疫耶尔森菌v蛋白的检测试剂中的应用；

55、(5)本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的基因改造的宿主细胞和/或本发明第五方面所述的检测试剂在制备用于检测鼠疫耶尔森菌v蛋白的检测产品中的应用；

56、(6)本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的表达载体和/或本发明第四方面所述的基因改造的宿主细胞在制备用于治疗鼠疫耶尔森菌感染性疾病的药物组合物中的应用。