犬抗体文库的制作方法

发明领域本发明涉及并提供犬文库，例如适合于选择完全犬抗体的合成抗体文库。本发明还涉及编码犬抗体个体或集合的合成核酸序列，即编码犬抗体文库的核酸序列。提供了用于产生和使用这类文库的方法。特别地，本发明涉及通过使用合成种系序列以产生具有特定生物物理特性的完全犬抗体的文库来制备完全犬抗体文库。

背景技术：

1、免疫球蛋白，例如抗体，在制药工业中具有持续和日益增加的兴趣。自2000年以来，单克隆抗体的治疗市场呈指数增长，在2007年，美国20种销量最好的生物技术药物中有8种是治疗性单克隆抗体，每一种在全世界的年销售额都超过50亿美元。治疗性抗体改善了许多疾病的治疗，并日益改善了患者的生活质量，即使是最严重、最具有挑战性的疾病的患者。

2、伴侣动物例如狗发展出与人类相比类似的疾病，其基于类似的或甚至相同的生物学机制和病症。例如，淋巴瘤是犬的血液淋巴系统最常见的肿瘤。它代表所有犬肿瘤的约4.5％和所有恶性肿瘤的15％。犬淋巴瘤(cl)通常是迅速致命的，在诊断的1-3个月内造成死亡(squire等人,1973；steven e.crow,2008)。而且，据估计，美国五分之一的成年狗患有关节炎，并且狗已经被用作人关节疾病的模型，例如用于骨关节炎、前交叉韧带破坏和半月板损伤。

3、因此，治疗性单克隆抗体不仅提供了用于治疗人、而且还用于治疗狗的非常有前景的药物种类。

4、已经尝试使用抗体用于狗的治疗。甚至在美国食品和药物管理局(the u.s.foodand drug administration，fda)批准第一种用于人癌症治疗的单克隆抗体，1992年，美国农业部(the united states department of agriculture，usda)已经批准了用于患淋巴瘤的狗的单克隆抗体mab231。mab231是一种源自鼠科动物的单克隆抗体，其使用kohler和milstein于1975年开发的杂交瘤技术产生，并特异性结合犬淋巴瘤细胞系17-71(参见例如：us5169775a)。mab231被证明结合肿瘤细胞而不结合正常细胞，并具有治疗上需要的介导细胞毒性的鼠科动物同种型igg2a。

5、同时，在使用对抗体进行“犬源化(caninise)”并因此模拟犬抗体的方法。例如，gearing等人(bmc veterinary research 2013,9:226)公开了通过使用基于表达的犬免疫球蛋白序列的算法将现有的大鼠抗-ngf单克隆抗体转化成重组犬源化抗-ngf mab，从而产生“完全犬源化”抗-ngf单克隆抗体。

6、据发明人所知，以前既没有公开完全合成犬抗体文库，也没有公开具有预定的、多样的vh/vl组成的任何其它可靠的犬抗体文库。在本发明中，对天然存在的犬抗体序列的合理分析和文库的复杂设计，产生了首个完全合成犬抗体文库，其可广泛用于生物医学研究。另外，对于有益的特性例如高单体含量和高度热稳定性，对文库的成员(member)进行了选择。

7、至于筛选合成犬抗体文库的方法，可以使用在噬菌体、大肠杆菌(e.coli)、酵母等上展示。在优选的噬菌体展示中，例如，抗体作为融合多肽呈递在噬菌体的表面蛋白质上。使抗体-展示噬菌体颗粒与感兴趣的靶分子(例如固定在固相(例如微量滴定板、磁珠等)上或在溶液中)接触，从而进行亲和力选择。选择表达对靶分子具有亲和力的抗体的噬菌体，在选择循环(selection round)中洗去具有不结合靶分子的抗体的噬菌体，其通常称作“(生物)淘选(bio-panning)”。在噬菌体展示中，呈递在所选择的噬菌体上的抗体与编码该抗体的基因一一对应，因此，可以容易地识别出感兴趣的抗体。而且，编码抗体的基因可以容易地扩增，因此，噬菌体展示被广泛用作从大文库中筛选和分离抗体的方法。

技术实现思路

1、由于犬种系序列编码的免疫球蛋白序列预计在犬中不具有免疫原性，因此我们寻找代表最丰富的犬抗体种类的种系免疫球蛋白序列。

2、根据bao等人(veterinary immunology and immunopathology 137(2010)64-75)，犬抗体vh基因库(gene repertoire)包括80种vh区段(其中41种是功能性的，39种是假基因)、6种dh和3个jh区段。vh基因通过所述vh基因库中不同的v、d和j基因区段的组合形成，并通过在vd和vj接合处添加或缺失短编码序列而连接，以增加抗体的多样性。在生发中心进入之前发生的vdj重组不是完全随机的，而是特异性vh基因比其它vh基因更频繁地使用。

3、在犬中，识别出1-vh62(vs624)和1-vh44(vs635)是在脾b细胞中最频繁使用的vh区段，1-vh62出现率为27％，1-vh44为23.4％(bao等人,2010)。所有其余的vh以小于11％的频率使用。在犬中，存在三个vh家族(vh1、vh2和vh3)，其中大部分属于vh1家族，而2-vh51、2-vh64和2-vh66属于vh2家族，3-vh80代表仅有的vh3家族成员。

4、犬中的抗体轻链也基于由v和j基因区段编码的可变区和由κ和λ基因编码的恒定区。犬家族免疫球蛋白λ序列可以分成四个vlλ链家族[v-i(genbank登记号xm845300)、v-ii(genbank登记号xm543519)、v-iii(genbank登记号xm844188)和v-iv(genbank登记号xm844237)]。c.家族免疫球蛋白κ序列也可以分成四个vlκ链家族：v-i(gen bank登记号xm849621)、v-ii(gen bank登记号xm844874)、v-iii(gen bank登记号xm849629)和v-iv(gen bank登记号xm849668)序列(braganza等人,veterinary immunology andimmunopathology 139(2011)27-40)。发现狗表达90％的λ轻链，且仅表达10％的κ轻链(braganza等人,veterinary immunology and immunopathology 139(2011)27-40)。然而，迄今为止，犬的特定轻链的分布和排列以及犬中存在的vh/vl组合几乎没有表征。

5、基于文献中描述的vh基因的分布和序列相似性分析，选择特定的vh基因用于合成犬抗体文库。对于vl基因，使用braganza等人,2011中提供的信息和可在http://vgenerepertoire.org上获得的基于86种λ轻链种系序列和29种κ轻链种系序列的共有序列，以选择用于合成犬抗体文库的特定轻链种系序列。

6、我们测试了五种代表性的犬vh种系序列和六种代表性的犬vl种系序列(4λvl，2κvl)。在30种可能的vh/vl组合中，我们识别出6种表现出以下有益特性的组合：(i)它们在丝状噬菌体的尖端以fab形式表现出高展示率；(ii)它们以fab形式以高单体含量的可溶形式表达；和(iii)以igg形式以高单体含量表达。

7、框架的选择要选择成优化获得以下抗体的机会：该抗体具备有利生物物理特性，并且没有源自未经历过体内突变的合成文库的抗体的缺点。如本文所示例，这种有利的、期望的生物物理特性例如包括较高的稳定性和低的聚集倾向。

8、对于六种最有利的vh/vl组合，l-cdr3和h-cdr3区分别被高度多样化的l-cdr3和h-cdr3文库盒(library cassette)替代，从而获得大于5×109个成员的总体文库大小。实施各自的限制性位点，以便能够进行l-cdr3和h-cdr3-文库盒插入。

9、此外，从特定种系序列中去除不利的翻译后修饰(ptm)位点，以进一步优化各个vh或vl基因以及相应的蛋白质的表达和生物物理特性。

10、重要的是，意识到用于治疗应用的抗体制剂中发生的翻译后修饰。ptm不一定发生在产生用于最初的体外表征的抗体样品中，而是ptm可能发生在高浓度和长期储存条件下的抗体样品中，而且也在体内发生。因此，ptm可以干扰抗体稳定性和/或同质性，并可能导致抗体功能性的丧失。ptm的实例包括但不限于氧化(met、trp、his)、脱酰胺(asn、gln)、异构化(asp)或n-连接糖基化(asn)。

11、本公开提供合成犬抗体文库，优选包括至少一个种系vh1区和至少一个种系vl区的成员的文库。

12、一方面，本文提供的所述文库包括至少两个种系vh1区和至少两个种系vl区的成员。

13、一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库包括以下种系vh1区中的至少一个的成员：vs618(seq id no.:4)、vs624(seq idno.:1)和vs635(seq id no.:2)。

14、一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库包括以下种系vh1区中的至少两个的成员：vs618(seq id no.:4)、vs624(seq idno.:1)和vs635(seq id no.:2)。另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库还包括至少两个种系vl区的成员。

15、一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库包括以下种系vl区中的至少一个：vs236(κ)(seq id no.:12)、vs323(λ)(seq id no.:16)和vs365(λ)(seq id no.:13)。在本公开的一个实施方式中，所述种系vl区选自以下种系vl区：vs236(κ)(seq id no.:12)、vs323(λ)(seq id no.:16)和vs365(λ)(seq id no.:13)。

16、一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库包括以下种系vh区中的至少两个：vs618(seq id no.:4)、vs624(seq id no.:1)和vs635(seq id no.:2)，并包括以下种系vl区中的至少两个：vs236(κ)(seq id no.:12)、vs323(λ)(seq id no.:16)和vs365(λ)(seq id no.:13)。

17、另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库包括种系vh区：vs618(seq idno.:4)、vs624(seq id no.:1)和vs635(seq idno.:2)，并包括以下种系vl区：vs236(κ)(seq id no.:12)、vs323(λ)(seq id no.:16)和vs365(λ)(seq id no.:13)。

18、另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库由以下组成：种系vh区vs618(seq id no.:4)、vs624(seq id no.:1)和vs635(seq id no.:2)中的至少一个，和以下种系vl区vs236(κ)(seq id no.:12)、vs323(λ)(seq id no.:16)和vs365(λ)(seq id no.:13)中的至少一个。

19、另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库由以下组成：种系vh区vs618(seq id no.:4)、vs624(seq id no.:1)和vs635(seq id no.:2)中的至少两个，和以下种系vl区vs236(κ)(seq id no.:12)、vs323(λ)(seq id no.:16)和vs365(λ)(seq id no.:13)中的至少两个。

20、另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库由以下组成：种系vh区：vs618(seq id no.:4)、vs624(seq id no.:1)和vs635(seq id no.:2)，和以下种系vl区：vs236(κ)(seq id no.:12)、vs323(λ)(seq id no.:16)和vs365(λ)(seq id no.:13)。

21、另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中从种系vh区或种系vl区中的一个或多个中去除了翻译后修饰(ptm)位点。

22、另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库包括vh区：vs618(seq idno.:4)、vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vs635-ptm-少(seq id no.:7)，并包括vl区：vs236(κ)(seq id no.:12)、vs323-ptm-少(λ)(seq id no.:18)和vs365(λ)(seq id no.:13)。

23、另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库包括：vh1区vs618(seq idno.:4)和vl区vs236(κ)(seq id no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs236(κ)(seq id no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs323-ptm-少(λ)(seq id no.:18)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合以及vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合。

24、一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库包括以下种系vh1区中的至少两个的成员：vs618(seq id no.:4)、vs624(seq idno.:1)、vs628(seq id no.:5)和vs635(seq id no.:2)。另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库还包括至少两个种系vl区的成员。

25、一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库包括以下种系vl区中的至少一个：vs236(κ)(seq id no.:12)、vs321(λ)(seq id no.:14)、vs323(λ)(seq id no.:16)、vs365(λ)(seq id no.:13)和vs843(λ)(seq id no.:15)。

26、在本公开的一个实施方式中，所述种系vl区选自以下种系vl区：vs236(κ)(seq idno.:12)、vs321(λ)(seq id no.:14)、vs323(λ)(seq id no.:16)、vs365(λ)(seq id no.:13)和vs843(λ)(seq id no.:15)。

27、一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库包括以下种系vh区中的至少两个：vs618(seq id no.:4)、vs624(seq id no.:1)、vs628(seq id no.:5)和vs635(seq idno.:2)，并包括以下种系vl区中的至少两个：vs236(κ)(seq id no.:12)、vs321(λ)(seq idno.:14)、vs323(λ)(seq id no.:16)、vs365(λ)(seq id no.:13)和vs843(λ)(seq id no.:15)。

28、另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库包括种系vh区：vs618(seq idno.:4)、vs624(seq id no.:1)、vs628(seq idno.:5)和vs635(seq id no.:2)，和以下种系vl区：vs236(κ)(seq id no.:12)、vs321(λ)(seq id no.:14)、vs323(λ)(seq id no.:16)、vs365(λ)(seq id no.:13)和vs843(λ)(seq id no.:15)。

29、另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库由以下组成：以下种系vh区中的至少一个：vs618(seq id no.:4)、vs624(seq id no.:1)、vs628(seq id no.:5)和vs635(seq id no.:2)，和以下种系vl区中的至少一个：vs236(κ)(seq id no.:12)、vs321(λ)(seq id no.:14)、vs323(λ)(seq id no.:16)、vs365(λ)(seq idno.:13)和vs843(λ)(seqid no.:15)。

30、另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库由以下组成：以下种系vh区中的至少两个：vs618(seq id no.:4)、vs624(seq id no.:1)、vs628(seq id no.:5)和vs635(seq id no.:2)，和以下种系vl区中的至少两个：vs236(κ)(seq id no.:12)、vs321(λ)(seq id no.:14)、vs323(λ)(seq id no.:16)、vs365(λ)(seq idno.:13)和vs843(λ)(seqid no.:15)。

31、另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库由以下组成：种系vh区：vs618(seq id no.:4)、vs624(seq id no.:1)、vs628(seq id no.:5)和vs635(seq id no.:2)，和以下种系vl区：vs236(κ)(seq id no.:12)、vs321(λ)(seq id no.:14)、vs323(λ)(seqid no.:16)、vs365(λ)(seq id no.:13)和vs843(λ)(seq id no.:15)。

32、另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中从种系vh区或种系vl区中的一个或多个中去除了翻译后修饰(ptm)位点。

33、另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库包括vh区：vs618(seq idno.:4)、vs624-ptm-少(seq id no.:6)、vs628-ptm-少(seq id no.:10)和vs635-ptm-少(seq id no.:7)，和vl区：vs236(κ)(seq id no.:12)、vs321(λ)(seq id no.:14)、vs323-ptm-少(λ)(seq id no.:18)、vs365(λ)(seq id no.:13)和vs843(λ)(seq id no.:15)。

34、另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库包括以下vh/vl组合中的一个或多个：vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs236(κ)(seq id no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs236(κ)(seq id no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs323-ptm-少(λ)(seq id no.:18)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs843(λ)(seq id no.:15)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs843(λ)(seq id no.:15)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs843(λ)(seq id no.:15)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs323-ptm-少(λ)(seq id no.:18)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs323-ptm-少(λ)(seq id no.:18)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs321(λ)(seq idno.:14)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs321(λ)(seq id no.:14)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs321(λ)(seq id no.:14)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs236(κ)(seq id no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs628-ptm-少(seq id no.:10)和vl区vs236(κ)(seq id no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs628-ptm-少(seq id no.:10)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合以及vh1区vs628-ptm-少(seq id no.:10)和vl区vs843(λ)(seq id no.:15)的vh/vl组合。

35、另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链组合，其中所述可变重链和可变轻链组合的框架区包括本文公开的vh/vl组合中的一个或多个。

36、另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链组合，其中所述可变重链和可变轻链组合的框架区包括以下vh/vl组合中的一个或多个：vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs236(κ)(seq id no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs236(κ)(seq id no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs323-ptm-少(λ)(seq id no.:18)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合和vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs365(λ)(seqid no.:13)的vh/vl组合。

37、另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链组合，其中所述可变重链和可变轻链组合的框架区由以下vh/vl组合中的一个或多个组成：vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs236(κ)(seq id no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs236(κ)(seq id no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs323-ptm-少(λ)(seq id no.:18)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合和vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs365(λ)(seqid no.:13)的vh/vl组合。

38、另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链组合，其中所述可变重链和可变轻链组合的框架区由本文公开的vh/vl组合中的一个或多个组成。

39、另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链组合，其中所述可变重链和可变轻链组合的框架区包括以下vh/vl组合中的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个：vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs236(κ)(seq id no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs236(κ)(seq id no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs323-ptm-少(λ)(seq id no.:18)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合和vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合。

40、另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链组合，其中所述可变重链和可变轻链组合的框架区由以下vh/vl组合中的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个组成：vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs236(κ)(seq idno.:12)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs236(κ)(seq id no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs323-ptm-少(λ)(seq id no.:18)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合和vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合。

41、另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链组合，其中所述可变重链和可变轻链组合的框架区由本文公开的vh/vl组合中的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个组成。

42、另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链组合，其中所述可变重链和可变轻链组合的框架区由以下vh/vl组合中的一个或多个组成：vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs236(κ)(seq id no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs236(κ)(seq id no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs323-ptm-少(λ)(seq id no.:18)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs365(λ)(seqid no.:13)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs843(λ)(seq id no.:15)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs843(λ)(seq id no.:15)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs843(λ)(seq id no.:15)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs323-ptm-少(λ)(seq id no.:18)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs323-ptm-少(λ)(seq id no.:18)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs321(λ)(seq id no.:14)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs321(λ)(seq id no.:14)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs321(λ)(seq id no.:14)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seqid no.:7)和vl区vs236(κ)(seq id no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs628-ptm-少(seq idno.:10)和vl区vs236(κ)(seq id no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs628-ptm-少(seq id no.:10)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合以及vh1区vs628-ptm-少(seq id no.:10)和vl区vs843(λ)(seq id no.:15)的vh/vl组合。

43、另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中至少50％的抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链组合，其中所述可变重链和可变轻链组合的框架区包括以下vh/vl组合中的一个或多个：vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs236(κ)(seq id no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs236(κ)(seq id no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs323-ptm-少(λ)(seq id no.:18)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs843(λ)(seq id no.:15)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seqid no.:6)和vl区vs843(λ)(seq id no.:15)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq idno.:7)和vl区vs843(λ)(seq id no.:15)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs323-ptm-少(λ)(seq id no.:18)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs323-ptm-少(λ)(seq id no.:18)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs321(λ)(seq id no.:14)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs321(λ)(seq id no.:14)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs321(λ)(seq id no.:14)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs236(κ)(seqid no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs628-ptm-少(seq id no.:10)和vl区vs236(κ)(seq idno.:12)的vh/vl组合、vh1区vs628-ptm-少(seq id no.:10)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合以及vh1区vs628-ptm-少(seq id no.:10)和vl区vs843(λ)(seq id no.:15)的vh/vl组合。

44、另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链组合，其中所述可变重链和可变轻链组合的框架区由以下vh/vl组合中的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少8个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个组成：vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs236(κ)(seq id no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs236(κ)(seq id no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs323-ptm-少(λ)(seq id no.:18)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs365(λ)(seqid no.:13)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs843(λ)(seq id no.:15)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs843(λ)(seq id no.:15)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs843(λ)(seq id no.:15)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs323-ptm-少(λ)(seq id no.:18)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs323-ptm-少(λ)(seq id no.:18)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs321(λ)(seq id no.:14)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs321(λ)(seq id no.:14)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs321(λ)(seq id no.:14)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seqid no.:7)和vl区vs236(κ)(seq id no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs628-ptm-少(seq idno.:10)和vl区vs236(κ)(seq id no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs628-ptm-少(seq id no.:10)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合以及vh1区vs628-ptm-少(seq id no.:10)和vl区vs843(λ)(seq id no.:15)的vh/vl组合。

45、另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中至少50％的抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链组合，其中所述可变重链和可变轻链组合的框架区由以下vh/vl组合中的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少8个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个组成：vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs236(κ)(seq id no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs236(κ)(seq id no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs323-ptm-少(λ)(seq id no.:18)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs843(λ)(seq id no.:15)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seqid no.:6)和vl区vs843(λ)(seq id no.:15)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq idno.:7)和vl区vs843(λ)(seq id no.:15)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs323-ptm-少(λ)(seq id no.:18)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs323-ptm-少(λ)(seq idno.:18)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs321(λ)(seq id no.:14)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs321(λ)(seq id no.:14)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs321(λ)(seq id no.:14)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs236(κ)(seqid no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs628-ptm-少(seq id no.:10)和vl区vs236(κ)(seq idno.:12)的vh/vl组合、vh1区vs628-ptm-少(seq id no.:10)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合以及vh1区vs628-ptm-少(seq idno.:10)和vl区vs843(λ)(seq id no.:15)的vh/vl组合。

46、另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中至少80％的抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链组合，其中所述可变重链和可变轻链组合的框架区包括以下vh/vl组合中的一个或多个：vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs236(κ)(seq id no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs236(κ)(seq id no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs323-ptm-少(λ)(seq id no.:18)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs843(λ)(seq id no.:15)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seqid no.:6)和vl区vs843(λ)(seq id no.:15)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq idno.:7)和vl区vs843(λ)(seq id no.:15)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs323-ptm-少(λ)(seq id no.:18)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs323-ptm-少(λ)(seq id no.:18)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs321(λ)(seq id no.:14)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs321(λ)(seq id no.:14)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs321(λ)(seq id no.:14)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs236(κ)(seqid no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs628-ptm-少(seq id no.:10)和vl区vs236(κ)(seq idno.:12)的vh/vl组合、vh1区vs628-ptm-少(seq id no.:10)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合以及vh1区vs628-ptm-少(seq id no.:10)和vl区vs843(λ)(seq id no.:15)的vh/vl组合。

47、另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中至少50％的抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链组合，其中所述可变重链和可变轻链组合的框架区由以下vh/vl组合中的一个或多个组成：vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs236(κ)(seq id no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs236(κ)(seq id no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs323-ptm-少(λ)(seq id no.:18)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs843(λ)(seq id no.:15)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seqid no.:6)和vl区vs843(λ)(seq id no.:15)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq idno.:7)和vl区vs843(λ)(seq id no.:15)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs323-ptm-少(λ)(seq id no.:18)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs323-ptm-少(λ)(seq id no.:18)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs321(λ)(seq id no.:14)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs321(λ)(seq id no.:14)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs321(λ)(seq id no.:14)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs236(κ)(seqid no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs628-ptm-少(seq id no.:10)和vl区vs236(κ)(seq idno.:12)的vh/vl组合、vh1区vs628-ptm-少(seq id no.:10)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合以及vh1区vs628-ptm-少(seq id no.:10)和vl区vs843(λ)(seq id no.:15)的vh/vl组合。

48、另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中至少80％的抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链组合，其中所述可变重链和可变轻链组合的框架区由以下vh/vl组合中的一个或多个组成：vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs236(κ)(seq id no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs236(κ)(seq id no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs323-ptm-少(λ)(seq id no.:18)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs843(λ)(seq id no.:15)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seqid no.:6)和vl区vs843(λ)(seq id no.:15)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq idno.:7)和vl区vs843(λ)(seq id no.:15)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs323-ptm-少(λ)(seq id no.:18)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs323-ptm-少(λ)(seq id no.:18)的vh/vl组合、vh1区vs618(seq id no.:4)和vl区vs321(λ)(seq id no.:14)的vh/vl组合、vh1区vs624-ptm-少(seq id no.:6)和vl区vs321(λ)(seq id no.:14)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs321(λ)(seq id no.:14)的vh/vl组合、vh1区vs635-ptm-少(seq id no.:7)和vl区vs236(κ)(seqid no.:12)的vh/vl组合、vh1区vs628-ptm-少(seq id no.:10)和vl区vs236(κ)(seq idno.:12)的vh/vl组合、vh1区vs628-ptm-少(seq id no.:10)和vl区vs365(λ)(seq id no.:13)的vh/vl组合以及vh1区vs628-ptm-少(seq id no.:10)和vl区vs843(λ)(seq id no.:15)的vh/vl组合。

49、一方面，本文提供合成犬抗体文库，优选包括至少一个种系vh1区和/或至少两个种系vl区的成员这样的文库，其中基本上所述文库的全部vh/vl组合以fab形式高效地展示。

50、一方面，所述文库的所述vh/vl组合以fab形式展示，展示率为至少0.5fab/噬菌体。

51、一方面，本文提供合成犬抗体文库，优选包括至少一个种系vh1区和/或至少两个种系vl区的成员这样的文库，其中基本上全部vh/vl组合以fab形式在大肠杆菌中表达。在一实施方式中，以fab形式在大肠杆菌中表达的所述vh/vl组合具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的单体含量。

52、一方面，本文提供合成犬抗体文库，优选包括至少一个种系vh1区和/或至少两个种系vl区的成员这样的文库，其中基本上全部vh/vl组合以igg形式在哺乳动物系统中表达。在一实施方式中，以igg形式在哺乳动物系统中表达的所述vh/vl组合具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的单体含量。

53、一方面，本文提供合成犬抗体文库，优选包括至少一个种系vh1区和/或至少两个种系vl区的成员这样的文库，其中基本上全部vh/vl组合是热稳定的。

54、本公开还提供核酸分子的集合，该核酸分子编码所述合成犬抗体文库的抗体。

55、本公开还提供编码所述核酸分子的载体。

56、本公开还提供包括所述核酸分子或载体的重组宿主细胞。

57、本公开还提供分离对抗原具有特异性的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：

58、(a)使本公开的合成犬抗体文库与抗原接触；

59、(b)除去文库的不与抗原结合(或者对抗原不具有特异性)的成员；和

60、(c)回收文库的与抗原结合(或者对其具有特异性)的成员。

61、本公开还提供从前述文库或者根据前述方法分离的抗体。