程序性死亡-1(PD-1)的人单克隆抗体及使用抗PD-1抗体来治疗癌症的方法与流程

一般而言，本发明涉及治疗人类疾病和减少相关不良事件的免疫疗法。更具体的说，本发明涉及使用抗pd-1抗体和使用包括抗ctla-4抗体与抗pd-1抗体组合的联合免疫疗法来治疗癌症和/或减少与单独使用此类抗体进行的治疗有关的不良事件的发生率或程度。

背景技术：

0、发明背景

1、蛋白质程序性死亡1(pd-1)是cd28受体家族的抑制性成员，该家族还包括cd28、ctla-4、icos和btla。pd-1在活化的b细胞、t细胞和髓样细胞上表达(agata等人，同下；okazaki等人(2002)curr.opin.immunol.14:391779-82；bennett等人(2003)j immunol170:711-8)。根据加入单克隆抗体后对提升t细胞增殖的功能性影响发现了家族最初的成员，cd28和icos(hutloff等人(1999)nature 397:263-266；hansen等人(1980)immunogenics 10:247-260)。通过在凋亡细胞中筛选差异表达发现了pd-1(ishida等人(1992)embo j 11:3887-95)。通过分别在细胞毒性t淋巴细胞和th1细胞中筛选差异表达发现了家族的其它成员，ctla-4和btla。cd28、icos和ctla-4都具有能够同型二聚化的不成对半胱氨酸残基。相反，认为pd-1以单体形式存在，其缺少其它cd28家族成员中特有的不成对半胱氨酸残基。

2、pd-1基因是55kda的i型跨膜蛋白，其为ig基因超家族的一部分(agata等人(1996)int immunol 8:765-72)。pd-1含有接近膜的免疫受体酪氨酸抑制基序(itim)和远离膜的基于酪氨酸的转换基序(itsm)(thomas,m.l.(1995)j exp med 181:1953-6；vivier,e和daeron,m(1997)immunol today 18:286-91)。虽然与ctla-4结构类似，但pd-1缺少结合b7-1和b7-2所必需的mypppy基序。现已鉴定了pd-1的两种配体，pd-l1和pd-l2，其显示出在结合pd-1后下调t细胞活化(freeman等人(2000)j exp med 192:1027-34；latchman等人(2001)nat immunol 2:261-8；carter等人(2002)eur j immunol 32:634-43)。pd-l1和pd-l2都是b7同源物，其与pd-1结合，但不与其它cd28家族成员结合。pd-1的一种配体，pd-l1在多种人癌瘤中都很丰富(dong等人(2002)nat.med.8:787-9)。pd-1和pd-l1之间的相互作用导致渗入肿瘤的淋巴细胞减少、t细胞受体介导的增殖减少、及癌性细胞的免疫逃避(dong等人(2003)j.mol.med.81:281-7；blank等人(2005)cancer immunol.immunother.54:307-314；konishi等人(2004)clin.cancer res.10:5094-100)。可以通过抑制pd-1与pd-l1的局部相互作用来逆转免疫抑制，而且当pd-1与pd-l2的相互作用也被阻断时效果累加(iwai等人(2002)proc.nat’l.acad.sci.usa 99:12293-7；brown等人(2003)j.immunol.170:1257-66)。

3、pd-1是在活化的b细胞、t细胞和髓样细胞上表达的cd28家族的抑制性成员(agata等人，同上；okazaki等人(2002)curr opin immunol 14:391779-82；bennett等人(2003)jimmunol 170:711-8)。pd-1缺陷型动物形成多种自身免疫表型，包括自身免疫性心肌病及伴有关节炎和肾炎的狼疮样综合征(nishimura等人(1999)immunity 11:141-51；nishimura等人(2001)science 291:319-22)。此外，发现pd-1在自身免疫性脑脊髓炎、系统性红斑狼疮、移植物抗宿主病(gvhd)、i型糖尿病和类风湿性关节炎中起作用(salama等人(2003)j exp med 198:71-78；prokunina和alarcon-riquelme(2004)hum mol genet 13:r143；nielsen等人(2004)lupus 13:510)。在鼠b细胞肿瘤系中，pd-1的itsm显示出是阻断bcr介导的ca2+流通和下游效应器分子的酪氨酸磷酸化所必需的(okazaki等人(2001)pnas98:13866-71)。

4、因此，需要识别pd-1的试剂和使用此类试剂的方法。

技术实现思路

0、发明概述

1、本发明提供了分离的单克隆抗体，特别是人单克隆抗体，其与pd-1结合并表现出许多优良特性。这些特性包括例如与人pd-1高亲和力结合，但缺少与人cd28、ctla-4或icos的基本的交叉反应性。此外，本发明的抗体显示出可调控免疫应答。因此，本发明的另一方面涉及使用抗pd-1抗体调控免疫应答的方法。具体而言，本发明提供了使用抗pd-1抗体在体内抑制肿瘤细胞生长的方法。

2、在一方面，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体表现出至少一项下列性质：

3、(a)以1x10-7m或更小的kd与人pd-1结合；

4、(b)不显著与cd28、ctla-4或icos结合；

5、(c)在混合淋巴细胞反应(mlr)测定法中增加t细胞增殖；

6、(d)在mlr测定法中增加干扰素γ的产量；

7、(e)在mlr测定法中增加il-2的分泌；

8、(f)与人pd-1和猕猴pd-1结合；

9、(g)抑制pd-l1和/或pd-l2与pd-1的结合；

10、(h)刺激抗原特异性记忆应答；

11、(i)刺激抗体应答；

12、(j)抑制体内肿瘤细胞生长。

13、所述抗体优选为人抗体，虽然在可选的实施方式中抗体可以为例如鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体。

14、在更优选的实施方式中，抗体以5x10-8或更小的kd与人pd-1结合，以1x10-8m或更小的kd与人pd-1结合，以5x10-9m或更小的kd与人pd-1结合，或以1x10-8m和1x10-10m之间的kd与人pd-1结合。

15、在另一实施方式中，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体与参照抗体交叉竞争与pd-1的结合，该参照抗体包含：

16、(a)人重链可变区，其包含选自seq id nos:1、2、3、4、5、6和7的氨基酸序列；和

17、(b)人轻链可变区，其包含选自seq id nos:8、9、10、11、12、13和14的氨基酸序列。

18、在多种实施方式中，所述参照抗体包含：

19、(a)重链可变区，其包含seq id no:1的氨基酸序列；和

20、(b)轻链可变区，其包含seq id no:8的氨基酸序列；或所述参照抗体包含：

21、(a)重链可变区，其包含seq id no:2的氨基酸序列；和

22、(b)轻链可变区，其包含seq id no:9的氨基酸序列；或所述参照抗体包含：

23、(a)重链可变区，其包含seq id no:3的氨基酸序列；和

24、(b)轻链可变区，其包含seq id no:10的氨基酸序列；或所述参照抗体包含：

25、(a)重链可变区，其包含seq id no:4的氨基酸序列；和

26、(b)轻链可变区，其包含seq id no:11的氨基酸序列；或所述参照抗体包含：

27、(a)重链可变区，其包含seq id no:5的氨基酸序列；和

28、(b)轻链可变区，其包含seq id no:12的氨基酸序列，或所述参照抗体包含：

29、(a)重链可变区，其包含seq id no:6的氨基酸序列；和

30、(b)轻链可变区，其包含seq id no:13的氨基酸序列，或所述参照抗体包含：

31、(a)重链可变区，其包含seq id no:7的氨基酸序列；和

32、(b)轻链可变区，其包含seq id no:14的氨基酸序列。

33、在另一方面，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人vh 3-33基因的重链可变区，其中所述抗体与pd-1特异性结合。本发明进一步提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人vh 4-39基因的重链可变区，其中所述抗体与pd-1特异性结合。本发明进一步提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人vk l6基因的轻链可变区，其中所述抗体与pd-1特异性结合。本发明进一步提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人vk l15基因的轻链可变区，其中所述抗体与pd-1特异性结合。

34、在一优选的实施方式中，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：

35、(a)人vh 3-33基因的重链可变区；和

36、(b)人vk l6基因的轻链可变区；

37、其中所述抗体与pd-1特异性结合。

38、在另一优选的实施方式中，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：

39、(a)人vh 4-39基因的重链可变区；和

40、(b)人vk l15基因的轻链可变区；

41、其中所述抗体与pd-1特异性结合。

42、在另一方面，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：

43、重链可变区，其包含cdr1、cdr2和cdr3序列；和

44、轻链可变区，其包含cdr1、cdr2和cdr3序列，

45、其中：

46、(a)所述重链可变区cdr3序列包含选自seq id nos:29、30、31、32、33、34和35及其保守修饰的氨基酸序列；

47、(b)所述轻链可变区cdr3序列包含选自seq id nos:50、51、52、53、54、55和56及其保守修饰的氨基酸序列；且

48、(c)所述抗体与人pd-1特异性结合。

49、优选的是，所述重链可变区cdr2序列包含选自seq id nos:22、23、24、25、26、27和28所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；所述轻链可变区cdr2序列包含选自seq idnos:43、44、45、46、47、48和49所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列。优选的是，所述重链可变区cdr1序列包含选自seq id nos:15、16、17、18、19、20和21所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；所述轻链可变区cdr1序列包含选自seq id nos:36、37、38、39、40、41和42所示氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列。

50、在又一方面，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：

51、(a)所述重链可变区包含与选自seq id nos:1、2、3、4、5、6和7的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；

52、(b)所述轻链可变区包含与选自seq id nos:8、9、10、11、12、13和14的氨基酸至少80％同源的氨基酸序列；

53、(c)所述抗体以1x10-7m或更小的kd与人pd-1结合；且

54、(d)所述抗体不显著与人cd28、ctla-4或icos结合。

55、在一优选的实施方式中，所述抗体另外还包含至少一项下列性质：

56、(a)所述抗体在mlr测定法中增加t细胞的增殖；

57、(b)所述抗体在mlr测定法中增加干扰素-γ的产量；或

58、(c)所述抗体在mlr测定法中增加il-2的分泌。

59、另外/或者，所述抗体可以包含一种或多种其它的上述特征。

60、在优选的实施方式中，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：

61、(a)重链可变区cdr1，其包含选自seq id nos:15、16、17、18、19、20和21的氨基酸序列；

62、(b)重链可变区cdr2，其包含选自seq id nos:22、23、24、25、26、27和28的氨基酸序列；

63、(c)重链可变区cdr3，其包含选自seq id nos:29、30、31、32、33、34和35的氨基酸序列；

64、(d)轻链可变区cdr1，其包含选自seq id nos:36、37、38、39、40、41和42的氨基酸序列；

65、(e)轻链可变区cdr2，其包含选自seq id nos:43、44、45、46、47、48和49的氨基酸序列；和

66、(f)轻链可变区cdr3，其包含选自seq id nos:50、51、52、53、54、55和56的氨基酸序列；

67、其中所述抗体与pd-1特异性结合。

68、一优选的组合包括：

69、(a)重链可变区cdr1，其包含seq id no:15；

70、(b)重链可变区cdr2，其包含seq id no:22；

71、(c)重链可变区cdr3，其包含seq id no:29；

72、(d)轻链可变区cdr1，其包含seq id no:36；

73、(e)轻链可变区cdr2，其包含seq id no:43；和

74、(f)轻链可变区cdr3，其包含seq id no:50。

75、另一优选的组合包括：

76、(a)重链可变区cdr1，其包含seq id no:16；

77、(b)重链可变区cdr2，其包含seq id no:23；

78、(c)重链可变区cdr3，其包含seq id no:30；

79、(d)轻链可变区cdr1，其包含seq id no:37；

80、(e)轻链可变区cdr2，其包含seq id no:44；和

81、(f)轻链可变区cdr3，其包含seq id no:51。

82、另一优选的组合包括：

83、(a)重链可变区cdr1，其包含seq id no:17；

84、(b)重链可变区cdr2，其包含seq id no:24；

85、(c)重链可变区cdr3，其包含seq id no:31；

86、(d)轻链可变区cdr1，其包含seq id no:38；

87、(e)轻链可变区cdr2，其包含seq id no:45；和

88、(f)轻链可变区cdr3，其包含seq id no:52。

89、另一优选的组合包括：

90、(a)重链可变区cdr1，其包含seq id no:18；

91、(b)重链可变区cdr2，其包含seq id no:25；

92、(c)重链可变区cdr3，其包含seq id no:32；

93、(d)轻链可变区cdr1，其包含seq id no:39；

94、(e)轻链可变区cdr2，其包含seq id no:46；和

95、(f)轻链可变区cdr3，其包含seq id no:53。

96、另一优选的组合包括：

97、(a)重链可变区cdr1，其包含seq id no:19；

98、(b)重链可变区cdr2，其包含seq id no:26；

99、(c)重链可变区cdr3，其包含seq id no:33；

100、(d)轻链可变区cdr1，其包含seq id no:40；

101、(e)轻链可变区cdr2，其包含seq id no:47；和

102、(f)轻链可变区cdr3，其包含seq id no:54。

103、另一优选的组合包括：

104、(a)重链可变区cdr1，其包含seq id no:20；

105、(b)重链可变区cdr2，其包含seq id no:27；

106、(c)重链可变区cdr3，其包含seq id no:34；

107、(d)轻链可变区cdr1，其包含seq id no:41；

108、(e)轻链可变区cdr2，其包含seq id no:48；和

109、(f)轻链可变区cdr3，其包含seq id no:55。

110、另一优选的组合包括：

111、(a)重链可变区cdr1，其包含seq id no:21；

112、(b)重链可变区cdr2，其包含seq id no:28；

113、(c)重链可变区cdr3，其包含seq id no:35；

114、(d)轻链可变区cdr1，其包含seq id no:42；

115、(e)轻链可变区cdr2，其包含seq id no:49；和

116、(f)轻链可变区cdr3，其包含seq id no:56。

117、本发明其它优选的抗体或其抗原结合部分包含：

118、(a)重链可变区，其包含选自seq id nos:1、2、3、4、5、6和7的氨基酸序列；和

119、(b)轻链可变区，其包含选自seq id nos:8、9、10、11、12、13和14的氨基酸序列；

120、其中所述抗体与pd-1特异性结合。

121、一优选的组合包括：

122、(a)重链可变区，其包含seq id no:1的氨基酸序列；和

123、(b)轻链可变区，其包含seq id no:8的氨基酸序列。

124、另一优选的组合包括：

125、(a)重链可变区，其包含seq id no:2的氨基酸序列；和

126、(b)轻链可变区，其包含seq id no:9的氨基酸序列。

127、另一优选的组合包括：

128、(a)重链可变区，其包含seq id no:3的氨基酸序列；和

129、(b)轻链可变区，其包含seq id no:10的氨基酸序列。

130、另一优选的组合包括：

131、(a)重链可变区，其包含seq id no:4的氨基酸序列；和

132、(b)轻链可变区，其包含seq id no:11的氨基酸序列。

133、另一优选的组合包括：

134、(a)重链可变区，其包含seq id no:5的氨基酸序列；和

135、(b)轻链可变区，其包含seq id no:12的氨基酸序列。

136、另一优选的组合包括：

137、(a)重链可变区，其包含seq id no:6的氨基酸序列；和

138、(b)轻链可变区，其包含seq id no:13的氨基酸序列。

139、另一优选的组合包括：

140、(a)重链可变区，其包含seq id no:7的氨基酸序列；和

141、(b)轻链可变区，其包含seq id no:14的氨基酸序列。

142、本发明的抗体可以为例如全长抗体，例如igg1或igg4同种型的全长抗体。或者，所述抗体可以为抗体片段，诸如fab或fab’2片段，或单链抗体。

143、本发明还提供了免疫偶联物，其包含与治疗剂，诸如细胞毒素或放射性同位素连接的本发明抗体或其抗原结合部分。本发明还提供了双特异性分子，其包含与第二功能性模块连接的本发明抗体或其抗原结合部分，该第二功能性模块具有与所述抗体或其抗原结合部分不同的结合特异性。

144、还提供了组合物，其含有本发明的抗体或其抗原结合部分，或免疫偶联物，或双特异性分子，及药学可接受载体。

145、本发明还涵盖编码本发明抗体或其抗原结合部分的核酸分子，以及包含此类核酸的表达载体和包含此类表达载体的宿主细胞。此外，本发明提供了包含人免疫球蛋白重链和轻链转基因的转基因小鼠，其中所述小鼠表达本发明的抗体，以及从这样的小鼠制备的杂交瘤，其中所述杂交瘤产生本发明的抗体。

146、在又一方面，本发明提供了调控受试者中免疫应答的方法，其包括给受试者施用本发明的抗体或其抗原结合部分，使得受试者中的免疫应答得到调控。优选的是，本发明的抗体增强、刺激或增加受试者中的免疫应答。

147、在另一方面，本发明提供了抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，其包括给受试者施用治疗有效量的抗pd-1抗体或其抗原结合部分。在该方法中优选使用本发明的抗体，虽然其它抗pd-1抗体也能够替代(或与本发明的抗pd-1抗体联合)使用。例如，在抑制肿瘤生长的方法中可以使用嵌合的、人源化的或完全人的抗pd-1抗体。

148、在另一方面，本发明提供了治疗受试者中传染病的方法，其包括给受试者施用治疗有效量的抗pd-1抗体或其抗原结合部分。在该方法中优选使用本发明的抗体，虽然其它抗pd-1抗体也能够替代(或与本发明的抗pd-1抗体联合)使用。例如，在治疗传染病的方法中可以使用嵌合的、人源化的或完全人的抗pd-1抗体。

149、此外，本发明提供了增强受试者中对抗原的免疫应答的方法，其包括给受试者施用：(i)抗原；和(ii)抗pd-1抗体或其抗原结合部分，使得受试者中对抗原的免疫应答得到增强。抗原可以是例如肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或来自病原体的抗原。在该方法中优选使用本发明的抗体，虽然其它抗pd-1抗体也能够替代(或与本发明的抗pd-1抗体联合)使用。例如，在增强受试者中对抗原的免疫应答的方法中可以使用嵌合的、人源化的或完全人的抗pd-1抗体。

150、本发明还提供了根据本文所提供的抗pd-1抗体的序列制备“二代”抗pd-1抗体的方法。例如，本发明提供了制备抗pd-1抗体的方法，其包括：

151、(a)提供：(i)重链可变区抗体序列，其包含选自seq id nos:15、16、17、18、19、20和21的cdr1序列，和/或选自seq id nos:22、23、24、25、26、27和28的cdr2序列；和/或选自seq id nos:29、30、31、32、33、34和35的cdr3序列；或(ii)轻链可变区抗体序列，其包含选自seq id nos:36、37、38、39、40、41和42的cdr1序列，和/或选自seq id nos:43、44、45、46、47、48和49的cdr2序列，和/或选自seq id nos:50、51、52、53、54、55和56的cdr3序列；

152、(b)改变选自重链可变区抗体序列和轻链可变区抗体序列的至少一个可变区抗体序列中的至少一个氨基酸残基以创建至少一个经改变的抗体序列；和

153、(c)将经改变的抗体序列表达成蛋白质。

154、下面的详述和实例用于表明本发明的其它特征和优点，不应作为限制。本技术中所引用的所有参考文献、genbank条目、专利和已公开的专利申请都通过参考清楚的引入。