一种探针组合及其构建靶向细胞原位成像的方法和应用

本发明属于分子生物学的，具体涉及一种探针组合及其构建靶向细胞原位成像的方法和应用。

背景技术：

1、细胞表面受体是一种独特的蛋白质，它可以识别细胞外基质的多种成分作为其配体，并在细胞信号传导和细胞间通信中发挥至关重要的作用。因此，靶向肿瘤细胞表面特异的细胞表面受体可以实现对肿瘤细胞的原位成像及检测，对于肿瘤早期诊断、治疗选择、预后评估等起着重要的作用。

2、目前研究者们已经开发了多种基于dna纳米技术的细胞表面受体的识别表征方法，其中以临近杂交反应(proximityligation assay，pla)应用最为广泛。pla通过成对的临近探针同时识别细胞表面的目标分子，经临近探针的连接后利用核酸扩增法可将细胞表面受体识别信号转化为dna检测，然而由于核酸扩增法需要对细胞或组织进行固定和预先透化，这大大限制了pla在肿瘤细胞原位成像中的应用，不利于将健康细胞和非健康细胞进行高效、快速、准确的区分。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种探针组合及其构建靶向细胞原位成像的方法和应用，具有高效、快速、准确区分肿瘤细胞和正常细胞的特点。

2、本发明提供了一种探针组合，所述探针组合包括识别探针和成像探针；所述识别探针包括探针t-1和探针t-2；

3、所述成像探针包括探针sa、探针sb、探针aa和探针ab；

4、所述探针sa由sa-f和sa-q合成；所述探针sb由sb-f和sb-q合成；

5、所述探针t-1的核苷酸序列如seq id no.1所示；

6、所述探针t-2的核苷酸序列如seq id no.2所示；

7、所述sa-f的核苷酸序列如seq id no.3所示；

8、所述sa-q的核苷酸序列如seq id no.4所示；

9、所述sb-f的核苷酸序列如seq id no.5所示；

10、所述sb-q的核苷酸序列如seq id no.6所示；

11、所述探针aa的核苷酸序列如seq id no.7所示；

12、所述探针ab的核苷酸序列如seq id no.8所示。

13、优选的，所述探针sa的合成方法包括：将所述sa-f和sa-q按摩尔比1：1.5～2进行第一混合，得到所述探针sa；

14、所述探针sb的合成方法包括：将所述sb-f和sb-q按摩尔比1：1.5～2进行第二混合，得到所述探针sb。

15、本发明提供了上述技术方案所述的探针组合在制备检测肿瘤的产品中的应用。

16、优选的，所述肿瘤包括肿瘤细胞。

17、优选的，所述肿瘤细胞包括肝癌细胞。

18、优选的，所述产品包括试剂盒和/或试剂。

19、本发明还提供了一种基于临近杂交反应构建靶向细胞原位成像的方法，包括如下步骤：

20、将待测样本与上述技术方案所述探针组合中的识别探针进行混合，得到孵育后的待测样本；

21、将所述待测样本与上述技术方案所述探针组合中的成像探针进行非线性杂交链式反应后，形成靶向细胞；

22、对所述靶向细胞依次进行固定、染色和激光共聚焦成像分析；

23、所述待测样本、sa、sb、aa、ab、t-1和t-2的摩尔比为0.5：1：2：2：4：0.5：0.5。

24、优选的，所述激光共聚焦成像分析包括：当靶向细胞的细胞边缘有橘红色荧光信号时，则待测样本为肿瘤细胞；当靶向细胞的细胞边缘无荧光信号时，则待测样本为正常细胞。

25、优选的，所述非线性杂交链式反应时间为1h，温度为37℃。

26、优选的，所述固定和染色的时间分别为15min。

27、有益效果：

28、本发明提供了一种探针组合，所述探针组合包括识别探针和成像探针；所述识别探针包括探针t-1和探针t-2；所述成像探针包括探针sa、探针sb、探针aa和探针ab；所述探针sa由sa-f和sa-q合成；所述探针sb由sb-f和sb-q合成；所述各探针的核苷酸序列如seqid no.1～seq id no.8所示。本发明提供的探针组合能够基于临近杂交反应触发肿瘤细胞形成树枝状纳米结构，进而在肿瘤细胞的表面形成荧光信号。

29、基于上述技术有优势，本发明还提供了一种基于临近杂交反应构建靶向肿瘤细胞原位成像的方法，包括如下步骤：将待测样本与上述技术方案所述探针组合中的识别探针进行混合，得到孵育后的待测样本；将所述待测样本与上述技术方案所述探针组合中的成像探针进行非线性杂交链式反应后，形成靶向细胞；对所述靶向细胞依次进行固定、染色和激光共聚焦成像分析；所述待测样本、sa、sb、aa、ab、t-1和t-2的摩尔比为0.5：1：2：2：4：0.5：0.5。实验证明，采用本发明提供的技术方案，hepg2细胞边缘有强烈的橘红色荧光信号，而正常l-02细胞则没有橘红色荧光信号，且hepg2细胞表面的荧光强度是l-02细胞的200倍(p＜0.001)。因此，本发明提供的技术方案可以进行肿瘤细胞的表面成像，从而高效、快速、准确地区分开肿瘤细胞和正常细胞。

技术特征：

1.一种探针组合，其特征在于，所述探针组合包括识别探针和成像探针；所述识别探针包括探针t-1和探针t-2；

2.根据权利要求1所述的探针组合，其特征在于，所述探针sa的合成方法包括：将所述sa-f和sa-q按摩尔比1：1.5～2进行第一混合，得到所述探针sa；

3.权利要求1或2所述的探针组合在制备检测肿瘤的产品中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括肿瘤细胞。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞包括肝癌细胞。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒和/或试剂。

7.一种基于临近杂交反应构建靶向细胞原位成像的方法，其特征在于，包括如下步骤：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述激光共聚焦成像分析包括：当靶向细胞的细胞边缘有橘红色荧光信号时，则待测样本为肿瘤细胞；当靶向细胞的细胞边缘无荧光信号时，则待测样本为正常细胞。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述非线性杂交链式反应时间为1h，温度为37℃。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述固定和染色的时间分别为15min。

技术总结
本发明属于分子生物学的技术领域，具体涉及一种探针组合及其构建靶向细胞原位成像的方法和应用。本发明提供的探针组合SEQ ID No.1～SEQ IDNo.8，能够基于临近杂交反应触发肿瘤细胞形成树枝状纳米结构，进而在肿瘤细胞的表面形成荧光信号，具有高效、快速、准确的特点。

技术研发人员：阳莎,唱凯,冯柳,陈鸣,邓杰忠,陈志国,赵著洋,罗兴,邓瑞佳,盛静
受保护的技术使用者：中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15