一种分离根结线虫寄生期幼虫的酶解液及其分离方法

本发明涉及幼虫分离获取领域，特别是涉及一种分离根结线虫寄生期幼虫的酶解液及其分离方法。

背景技术：

1、根结线虫是一种世界范围内广泛分布的重要植物病原线虫，可寄生危害多种粮食和园艺作物，造成重大经济损失。根结线虫属于专性固着性植物内寄生线虫，大部分生活史在寄主根系内完成。根结线虫侵染性幼虫进入根系后，会建立一个固定的取食位点，成为体型膨大不具备移动能力的寄生期幼虫(后期二龄幼虫、三龄幼虫和四龄幼虫)，并最终发育成为雌成虫。

2、研究表明，寄生期幼虫是取食、致病和抵抗防御反应的关键阶段。因此，获得大量完整的寄生期幼虫是开展根结线虫分子寄生致病机理研究的基本材料需求。由于寄生期幼虫呈固着态存活于根系内，需要对根系进行破碎才能将幼虫分离出来。

3、目前，获取寄生期幼虫的方法主要有人工解剖法和搅拌破碎法。人工解剖法即利用挑针和手术刀对根系进行人工解剖，并且在显微镜下观察单一逐个挑取膨大的幼虫。该方法劳动量耗费大，难度高，速度慢，且很难一次获得足够的虫量。搅拌破碎法是利用厨房搅拌器对根系进行快速破碎，从而将幼虫释放出来。然而该方法很容易造成虫体破碎失活，且通常虫体表面粘附带有根碎片残渣，同样难以获得大量高质量的虫体。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一一种分离根结线虫寄生期幼虫的酶解液及其分离方法，利用本发明提供的酶解液和方法从寄主植物根系中快速获取大量根结线虫寄生期幼虫，获取的寄生期活体幼虫可用于后续多种分子生物学实验，包括rna提取、发育表达、原位杂交等。该方法具有简单快捷、分离效率高以及所获虫体完整干净等优点。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明提供了一种分离根结线虫寄生期幼虫的酶解液，包括柠檬酸缓冲液、纤维素酶r-10、离析酶r-10和果胶酶，所述柠檬酸缓冲液与纤维素酶r-10、离析酶r-10、果胶酶的体积比为200:1:1:4。

4、优选的，所述纤维素酶r-10的酶活性>10,000u/g；

5、所述离析酶r-10的酶活性>3,000u/g；

6、所述果胶酶的酶活性≥3,800u/ml；

7、所述柠檬酸缓冲液的浓度为0.1m，ph值为5.0。

8、本发明还提供了一种根结线虫寄生期幼虫的分离方法，包括以下步骤：

9、1)将受根结线虫感染具有根结症状的植物根系与上述技术方案所述的酶解液混合后振荡，得到振荡物；

10、2)将所述步骤1)得到的振荡物依次过60目、100目、400目网筛，得到筛上物；

11、3)将所述步骤2)得到的筛上物经蔗糖溶液悬浮，在所述悬浮物上加一层水后进行离心，得到根结线虫寄生期幼虫。

12、优选的，所述步骤1)植物根系的长度为1cm；

13、所述植物根系清洗消毒后再与酶解液混合；

14、所述消毒的条件包括：将所述植物根系经质量百分含量为0.1％次氯酸钠溶液消毒5min，无菌水清洗10min。

15、优选的，所述步骤1)酶解液完全覆盖植物根系。

16、优选的，所述步骤1)振荡的条件包括：转速为180rpm，时间为6h，温度为30℃。

17、优选的，所述步骤3)蔗糖溶液的质量百分含量为60％。

18、优选的，所述步骤3)筛上物离心后再经蔗糖溶液悬浮；

19、所述离心的条件包括：转速为2000rpm，时间为2min，温度为25℃。

20、优选的，所述步骤3)离心的条件包括：转速为1000rpm，时间为5min，温度为25℃。

21、优选的，所述步骤3)水包括无菌水。

22、本发明分离根结线虫寄生期幼虫的机理为：根结线虫侵染进入植物根系后，在细胞与细胞间隙中生存发育。通过加入可以降解植物细胞壁的酶解液(纤维素酶r-10水解植物细胞壁主要成分纤维素；离析酶r-10半纤维素；果胶酶水解果胶成分)，虫体周围的植物细胞壁组织被酶解呈松弛状态，从而释放出虫体。

23、本发明的有益效果为：

24、利用本发明提供的酶解液和方法从寄主植物根系中快速获取大量根结线虫寄生期幼虫，获取的寄生期活体幼虫可用于后续多种分子生物学实验，包括rna提取、发育表达、原位杂交等。该方法具有简单快捷、分离效率高以及所获虫体完整干净等优点。

技术特征：

1.一种分离根结线虫寄生期幼虫的酶解液，其特征在于，包括柠檬酸缓冲液、纤维素酶r-10、离析酶r-10和果胶酶，所述柠檬酸缓冲液与纤维素酶r-10、离析酶r-10、果胶酶的体积比为200:1:1:4。

2.根据权利要求1所述的酶解液，其特征在于，所述纤维素酶r-10的酶活性>10,000u/g；

3.一种根结线虫寄生期幼虫的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，所述步骤1)植物根系的长度为1cm；

5.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述步骤1)酶解液完全覆盖植物根系。

6.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述步骤1)振荡的条件包括：转速为180rpm，时间为6h，温度为30℃。

7.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述步骤3)蔗糖溶液的质量百分含量为60％。

8.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述步骤3)筛上物离心后再经蔗糖溶液悬浮；

9.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述步骤3)离心的条件包括：转速为1000rpm，时间为5min，温度为25℃。

10.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述步骤3)水包括无菌水。

技术总结
本发明提供了一种分离根结线虫寄生期幼虫的酶解液及其分离方法，涉及植物寄生线虫分离获取领域。所述酶解液包括柠檬酸缓冲液、纤维素酶R‑10、离析酶R‑10和果胶酶。将具有根结症状的植物根系与酶解液混合后振荡，得到振荡物；将所述步骤1)得到的振荡物先后过60目、100目和400目网筛，得到筛上物；将得到的筛上物经蔗糖溶液悬浮，在所述悬浮物上加一层水后进行离心，得到根结线虫寄生期幼虫。利用本发明提供的方法从寄主植物根系中快速获取大量根结线虫寄生期幼虫，获取的寄生期活体幼虫可用于后续多种分子生物学实验，包括RNA提取、发育表达、原位杂交等。该方法具有简单快捷、分离效率高以及所获虫体完整干净等优点。

技术研发人员：龙海波,王帅丽,冯推紫,陈园,王丽,孙燕芳,裴月令
受保护的技术使用者：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15