一种结合深度学习算法的多色数字化核酸扩增检测方法

本发明涉及多重核酸检测，具体涉及一种结合深度学习算法的多色数字化核酸扩增检测方法。

背景技术：

1、分子诊断是当代快速检测发展的重要前沿领域之一，pcr作为重要的核酸分析工具，已从定性检测逐步向单分子定量发展，可实现真正意义上的数字化精确分析。除了pcr之外，目前已有很多等温核酸扩增技术(如lamp)在恒定的温度下就可实现模板的大量扩增，摆脱了pcr过程对温控的严格要求。所谓数字化核酸扩增(即数字pcr或数字lamp)，是将稀释的样本分配到大量独立的微反应单元，依据终点荧光读取进行分析，不受反应扩增效率的影响，具有极强的抗干扰能力和对多基因靶点的同时检测能力。多重pcr是指在同一体系中可扩增多种靶标基因的检测技术，当数字pcr结合到多重pcr中，可实现从多靶标基因的定性检测到多靶标数字化定量，即多重数字pcr。根据不同荧光和淬灭基团dna探针的标记、不同种类的微腔室芯片或微液滴的制备以及核酸扩增不同循环数的使用，可大幅提高多重数字pcr检测性能，实现多指标的并行检测，获取更丰富的检测信息，显著降低检测成本。因此，研发多重分子快速检测系统，开发相应的分子检测结果自动智能识别模型是有重要意义的。

2、相较于微流控体系实现的数字化定量，水凝胶数字lamp无需复杂操作即可在内部的纳米多孔中实现核酸的相对分隔，将水凝胶聚合物与lamp试剂和待测样品混合，可在短时间内聚合形成凝胶，并将样品固定在多孔通道中，如果样品中存在靶dna/rna，则会在多孔通道中产生荧光扩增点。利用凝胶的三维纳米限域作用对模板分子进行固定，形成微反应单元，不需要常规数字检测中的微纳加工等方式来完成核酸样品的分配，为现场检测提供了一个简单便捷的平台。

3、然而，目前的水凝胶扩增均是单重检测，即只能对单一目标物进行检测而不能同时检测多个目标。基于多色成像的水凝胶多重核酸数字化扩增还尚未报道，水凝胶内部纳米孔道的限域优势使其在检测多重食源性致病菌领域有着很大的应用潜力。

4、现有的多重分子检测技术常采用多种不同颜色的taqman探针来区分不同的目标物，这种核酸探针的两端分别标记荧光基团和淬灭基团，因此完整探针链无法呈现出荧光信号，在模板扩增时探针链会被切割，荧光基团会分散到溶液中发出对应的荧光。但这种方式无法在水凝胶中实现多色数字化检测，因为游离的荧光基团会分散在整个体系，不能对目标物进行限域单分子定量。同时taqman探针需要精心设计，与模板链有着很高的结合效率，才能保证探针链在扩增过程被切割并释放出荧光。因此，需要开发一种新型多色技术，实现水凝胶多色数字化核酸检测。

5、目前对于多色数字化检测的结果计数中，依据尺寸较均匀的微球、微液滴或微腔室完成的多色pcr数字化检测，都可简单地实现图像的识别计数。但是水凝胶lamp体系形成的荧光扩增点大小不一，而且水凝胶作为一种柔性材料，加热反应后的水凝胶基质偶尔会产生气泡。同时三维网状结构内的多重分子扩增的核酸产物会在扩散过程中相互靠近连接，肉眼识别计数费时费力，商业软件也不能自动识别多重模板分子的检测结果，无法准确计数检测目标物的荧光点。

6、因此，开发一种利用水凝胶体系同时检测多种核酸分子，并能够准确分析多色信号的多重数字化核酸检测方法是本领域技术人员需要解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种非诊断目的的多色数字化核酸扩增检测方法，利用水凝胶体系同时检测多种核酸分子，再结合机器学习方法实现多色信号的准确分析。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明提供了一种结合深度学习算法的多色数字化核酸扩增检测方法，包括以下步骤：

4、(1)将待测样品加入到环介导等温扩增反应体系溶液中，所述反应体系包括针对不同目标分子的特异性扩增引物对和淬灭探针，所述引物对包括内引物，其中一条内引物上标记荧光基团，针对不同目标分子的内引物上标记不同的光谱可区分荧光基团，所述淬灭探针与内引物部分序列碱基互补且溶解温度低于环介导等温扩增反应温度，淬灭探针上携带有用于淬灭与之互补内引物上荧光基团发光的淬灭基团，然后加入水凝胶单体，交联形成水凝胶，得到待测样品水凝胶反应体系；

5、(2)将水凝胶反应体系置于恒温条件下进行等温扩增反应；

6、(3)反应结束后，利用荧光成像技术记录水凝胶体系在不同荧光通道下的荧光点图像，合并获得多色分子荧光点图像，将合并图像输入深度学习模型，输出多色分子的计数结果；

7、所述深度学习模型的构建方法包括：

8、s1，按照步骤(1)-(3)，将待测样品替换成含有不同目标分子的标准溶液得到多色分子水凝胶反应体系进行等温扩增反应，荧光成像后获得合并图像；

9、s2，对合并图像中的荧光点进行标注，获得数据集，然后针对数据集进行yolov8模型的训练，得到深度学习模型。

10、本发明利用水凝胶独特的分子筛特性以及三维网状结构，替代了传统用微流体技术进行核酸扩增区室化，采用特异性探针进行多色分子检测，避免了非特异性核酸染料的使用。水凝胶的纳米多孔基质将多重模板分子固定在孔道中，核酸扩增反应试剂、引物、淬灭探针等可在水凝胶基质中自由扩散。由于淬灭探针与内引物溶解温度低于环介导等温扩增反应温度，因此在环介导等温扩增的温度条件下，标记荧光基团的内引物不断参与lamp反应过程，进入核酸产物中，产生明亮的荧光信号，扩增产物限位于纳米孔道中形成荧光点。而反应结束后在室温条件下多余内引物的荧光被互补探针杂交淬灭，降低了扩增点背景的荧光干扰，实现多色水凝胶lamp的分子扩增。

11、所述目标分子可以为食源性致病微生物dna，所述致病微生物包括细菌、真菌、病毒，可以为但不限于大肠杆菌、沙门氏菌或李斯特菌。

12、待测样品可以先经核酸提取处理，再加入到lamp反应体系；也可以直接加入到含有溶菌酶或逆转录酶的lamp反应体系，所述溶菌酶可以直接裂解待测样品里的细菌，所述逆转录酶可以将rna逆转录成cdna。

13、步骤(1)中，根据每一个目标分子，设计对应的特异性扩增引物对和淬灭探针。具体的，分别在各自的内引物上修饰具有不同发光波长的荧光基团，然后基于互补碱基，设计对应的探针序列和淬灭基团。

14、针对不同的目标分子，在其内引物上标记不同的光谱可分辨的荧光基团，通过核酸扩增获得具有光谱可区分的扩增产物。进一步的，所述荧光基团为6-fam、amca、pacificblue、atto 425、hex、vic、tet、rox、joe、cy3、cy5中任意一种。

15、进一步的，所述内引物包括上游内引物(fip)和下游内引物(bip)，在上游内引物的5’端标记荧光基团；所述淬灭探针与内引物的靠近5’端部分的序列互补，互补部分占内引物序列长度的50～60％且溶解温度比lamp扩增温度低8～12℃，用于淬灭荧光基团的淬灭基团修饰于淬灭探针的3’端。

16、本发明采用荧光扩增信号的不对称淬灭探针，实现了特异性的多色核酸分子检测。在内引物5’端标记荧光基团，在互补序列3’端设计荧光淬灭剂，以形成更高的信噪比，明显区分多重分子检测信号。两种序列互补的溶解温度需比lamp扩增温度低10℃左右，以不干扰正常的水凝胶lamp多色分子检测过程。

17、具体的，本发明分别采用fam和rox荧光基团作为绿色和红色通道标记荧光扩增点，无需额外组分，水凝胶内部的核酸团可以直接发出絮凝的荧光信号。为进一步提高信号信噪比，采用tamra和bhq2分别淬灭多余的未合并在扩增产物的游离绿色和红色荧光。

18、本发明结合分子探针技术，根据目标分子种类数量构建水凝胶多色分子检测体系。所述的环介导等温扩增反应体系包括：等温扩增缓冲液、镁离子、dntp、bst 2.0dna聚合酶、引物混合物、淬灭探针和水凝胶单体。构建反应体系时，可结合实际情况对各原料添加量做出调整。

19、进一步的，反应体系中针对每种目标分子的引物包括1.6μm fib和bip，0.2μm f3和b3与0.8μm lf和lb。

20、进一步的，当荧光基团采用6-fam，淬灭基团采用tamra，反应体系中上游内引物与淬灭探针的摩尔比为5：4；当荧光基团采用rox，淬灭基团采用bhq2，反应体系中上游内引物与淬灭探针的摩尔比为5：1。

21、进一步的，本发明采用聚乙二醇基水凝胶，所述水凝胶单体包括四臂乙二醇丙烯酸酯(4arm-peg-acrl)和巯基-聚乙二醇-巯基(sh-peg-sh)。上述两种单体在水溶液中混合，室温条件下成胶，时间为3-5分钟。

22、进一步的，四臂乙二醇丙烯酸酯的分子量为10000mw，巯基-聚乙二醇-巯基的分子量为3400mw，两者的摩尔比为1：2。

23、步骤(2)中，水凝胶体系置于防止水分蒸发的密封空间内进行等温扩增反应。利用密封空间防止水凝胶中的水分蒸发，保证检测结果的准确性。具体地，将混合后的体系溶液滴加到透明的密封小室中，静置成胶，用薄膜密封。密封小室和薄膜构成的密封体系可以防止水分蒸发。

24、进一步的，等温扩增反应的条件为65～70℃加热20～30min。

25、步骤(3)中，在不同波长的激发光源下，多色检测体系呈现出不同荧光的扩增点，分别拍摄各通道的荧光信号图片，采用软件合并，在同一个图片中得到多重扩增点信号。

26、进一步的，在荧光基团对应的激发光源下，采集荧光信号图像，然后采用image j软件将不同荧光通道下的图像合并。

27、本发明的peg水凝胶为三维网状结构，多色检测的模板核酸分子被限域在内部的纳米多孔基质，扩增完成后形成荧光核酸扩增团。但成像结果的拍摄处于二维平面空间，可能出现多种荧光点相连的情况，人工计数无法满足快速简单的计数需求，image j软件也无法准确计数多色peg-lamp分子检测结果。因此，本发明借助深度学习算法，训练模型，从荧光杂质和气泡中准确识别扩增点，并区分有重合的荧光点，实现多色数字化检测的准确计数。

28、深度学习是一种基于神经网络的机器学习方法，从原始数据中提取特征进行检测、分类或回归，凭借强大的自动特征学习能力，可以快速有效地智能化解决问题。本发明通过辅以人工特征提取训练最佳神经网络模型，能够有效区分气泡和荧光杂质，并准确计数相连的扩增点。

29、具体的，本发明采用yolov8算法来构建识别计数模型，机器学习时，以标注的水凝胶图片作为输入，以荧光核酸点数量和/或对荧光点标注的图片作为输出。

30、为了增加模型的性能、速度和准确性，对采集的图像数据进行处理，具体的，使用roboflow平台对合并图像中的扩增点进行标注，获得数据集，然后将数据集增加3倍，可以更好地提取荧光扩增点特征，泛化模型。根据map数值评估模型性能，选取最佳的模型超参数和配置，具体的，模型训练的超参数和配置为：adam优化器、16batch size、0.001lr0和0.01lrf。

31、利用本发明训练得到的深度学习模型可以有效区分扩增气泡，从二维图像上自动识别并准确计数高空间接近度的多种核酸分子。检测每张图片的时间范围为3～8s。

32、本发明具备的有益效果：

33、(1)本发明提供了一种深度学习识别的多色数字化核酸扩增检测方法，借助不同的分子探针，实现了多种模板分子的快速检测。水凝胶纳米多孔基质将多重模板分子固定在孔道中实现原位扩增。标记荧光基团的内引物不断参与lamp反应过程，进入核酸产物中，产生明亮的荧光信号，而多余内引物的荧光被不对称互补探针杂交淬灭，降低了扩增点的荧光背景干扰，形成较高的信噪比，实现了多色peg-lamp的特异性分子扩增。

34、(2)本发明结合深度学习算法构建针对多色peg-lamp分子检测图片进行自动识别计数的模型，利用该模型可以从荧光杂质和气泡中明显区分核酸扩增点，准确地计数高空间接近度的多种核酸分子，计数准确性高于常用的image j软件，为多色分子检测的识别和绝对定量计数提供了一种准确的方法。

35、(3)本发明提供的结合深度学习的多色数字化核酸扩增检测方法，能在实际样品混合果蔬汁中进行直接无干扰的多重扩增。操作过程非常简单，扩增时间快，多色分子检测准确性高，深度学习模型自动识别速度快，在多色食源性致病菌分子检测领域具有很好的商业应用价值。