一种抗冻蛋白及其基因、酵母工程菌和应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种抗冻蛋白、表达抗冻蛋白的工程菌及其构建方法和应用。

背景技术：

1、科学研究过程中经常会用到细胞冻存技术，细胞在冻存过程中会受到冰晶引起的细胞坏死和凋亡，为了减少这种损伤，我们通常在细胞冻存液中加入甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇、二甲基亚砜（dmso）等，这些渗透性冷冻保护剂可以使细胞膜明显松弛，使细胞更容易适应低温保存过程中的压力。但是由于其具有渗透性因此对细胞具有一定毒性，对于细胞膜蛋白有损害。

2、抗冻蛋白最早是在南极鱼的血液中发现的，随后发现其存在于生活在极地地区的各种生物中，例如鱼类、昆虫、植物、细菌和真菌等。抗冻蛋白是一种特殊的大分子蛋白质，它可以特异性地降低溶液的冰点而不影响其熔点，这样冰点与熔点间产生的差值称为热滞活性，从而可以阻止冰核形成，控制冰晶的生长，维持体液的液体状态，在一定程度上提高生物的抗冻能力。

3、长期处于冰雪覆盖下的南极海洋是世界上最严酷的生存环境，但是依然有生物通过在体内产生抗冻蛋白从而实现对这种环境的适应。南极鱼中已发现并且经验证具有活性的抗冻蛋白有卵壳蛋白zpc5，抗冻蛋白ld4和钙调素基因，其中体外表达并且纯化的zpc5在体外具有抑制冰晶生长的作用，而ld4蛋白和钙调素基因在烟草中过表达后具有提高其低温抵抗力的作用。

4、除了南极鱼，还在昆虫中发现云山卷叶蛾（ choristoneurafumiferana）抗冻蛋白（cfafp），其在大肠杆菌表达系统中进行表达，获得的重组蛋白具有显著抑制冰晶生长的作用。此外，一种生活在南极的昆虫雪蚤体内也存在高活性的抗冻蛋白，研究者发现其在毫摩尔浓度下的抗冻活性是鱼类抗冻蛋白活性的10 ~ 100倍。以上研究表明抗冻蛋白不论是在体内还是在体外都有一定的抗寒或者抗冻作用，这种作用使其可以被广泛应用到转基因耐寒作物育种、食品冷冻运输、细胞的冷冻保存等方面。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一种抗冻蛋白（hhafp）及其编码基因和应用。

2、本发明还提供了上述抗冻蛋白的表达系统、酵母工程菌以及高效表达抗冻蛋白的方法。

3、本发明的技术方案如下：

4、一种抗冻蛋白（hhafp），含有如seq id no.1所示的氨基酸序列。

5、seq id no.1:

6、mrvaevakvlwvgvcavaavtlvvgvqevvkvvwvvwvwgvqavvlvvavvatvvvcflvvhvvrvvtvcgrvaevagvag。

7、优选的，所述的抗冻蛋白，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

8、在本发明的一个实施例中，所述抗冻蛋白的c端还带有his标签。

9、所述抗冻蛋白的n端还带有1个或2个信号肽切割位点氨基酸。信号肽切割位点氨基酸为kr或者r。

10、一种抗冻蛋白基因，编码上述抗冻蛋白。

11、优选的，所述抗冻蛋白基因含有 seq id no.2所示的核苷酸序列。

12、更优选的，所述抗冻蛋白基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；或者，在其3’端带有编码his标签的核苷酸序列。

13、或者，在其5’端带有编码1个或2个信号肽切割位点氨基酸的序列。优选为kex 2信号肽切割位点；信号肽切割位点氨基酸为kr或者r。

14、seq id no.2:

15、atgcgtgttgcagaagtggcaaaagtgctgtgggtgggtgtgtgtgcagtagcagcagtgaccctggtggtgggggtgcaggaggtggtgaaggtggtgtgggtcgtctgggtttggggagttcaggcagttgttcttgttgttgccgtggtggccaccgtggttgtctgctttctggttgttcatgttgttcgtgtcgtgacagtttgtggccgcgtggctgaagttgcaggtgttgccggt。

16、所述的抗冻蛋白或抗冻蛋白基因，可用于细胞冷冻保存或者冷冻食品保鲜，所述抗冻蛋白或抗冻蛋白基因可用于制备细胞冷冻保存液、冷冻保鲜剂或者冷冻食品。所述的抗冻蛋白基因还可用于转基因耐寒植物的育种，培育耐寒植物。

17、一种重组表达载体，含有表达上述抗冻蛋白的基因。

18、优选的，所述的重组表达载体含有表达分泌信号肽的基因。在本发明的一个优选方案中，所述的重组表达载体采用ppiczαa质粒。

19、本发明的一个优选方案，所述重组表达载体含有能够表达seq id no.6所示蛋白的核苷酸序列。

20、seq id no.6：

21、

22、 其中双下划线为表分泌信号肽α-factor（1-83），波浪线为kex 2信号肽切割位点（84-85），单下划线为抗冻蛋白（hhafp）序列（86-166），虚下划线代表his标签序列。

23、本发明的一个优选方案，所述重组表达载体中含有seq id no. 5的序列。

24、seq id no. 5：

25、atgagatttccttcaatttttactgctgttttattcgcagcatcctccgcattagctgctccagtcaacactacaacagaagatgaaacggcacaaattccggctgaagctgtcatcggttactcagatttagaaggggatttcgatgttgctgttttgccattttccaacagcacaaataacgggttattgtttataaatactactattgccagcattgctgctaaagaagaaggggtatctctcgagaaaagaatgcgtgttgcagaagtggcaaaagtgctgtgggtgggtgtgtgtgcagtagcagcagtgaccctggtggtgggggtgcaggaggtggtgaaggtggtgtgggtcgtctgggtttggggagttcaggcagttgttcttgttgttgccgtggtggccaccgtggttgtctgctttctggttgttcatgttgttcgtgtcgtgacagtttgtggccgcgtggctgaagttgcaggtgttgccggtcatcatcatcatcatcattgatag。

26、一种表达抗冻蛋白的酵母工程菌，酵母基因中含有编码上述抗冻蛋白hhafp的核苷酸序列。

27、优选的，所述酵母工程菌，酵母基因中还含有编码分泌信号肽kex 2和信号肽切割位点的基因片段。

28、所述的酵母工程菌的宿主菌为毕赤酵母，优选为毕赤酵母x-33。

29、构建上述酵母工程菌的方法，步骤包括：

30、（1）以上述抗冻蛋白基因为模板扩增，获得5’端具有 xhoi，3’端具有 xbai酶切位点和6×his标签编码基因的目标片段；

31、（2）所述的目标片段连接到表达载体上，构建重组表达载体；

32、（3）所述的重组表达载体线性化，转入宿主酵母菌中，筛选阳性转化子，得到重组的酵母工程菌。

33、步骤（1）中， 以编码seq no.1所示的氨基酸序列基因为模板进行扩增。优选的，步骤（1）中，用seq id no.3 和seqid no.4所示的引物进行扩增。

34、seq id no.3 （hhafp-f）： ctcgagaaaagaatgcgtgttgcagaagtg

35、seq id no.4（hhafp-r）：tctagactatcaatgatgatgatgatgatgaccggcaacacctgcaacttc

36、扩增得到目标片段长度为285bp，并带有xhoi、xbai 酶切位点和 6×his 标签。

37、步骤（2）所述的表达载体为ppiczαa质粒。在hhafp基因的5’端添加 xhoi酶切位点，在 3’端添加 xbai酶切位点和6×his标签。用 xhoi 、xbai酶对目标片段和ppiczαa质粒进行双酶切并连接，构建重组表达载体ppiczαa- hhafp。

38、步骤（3）中，用 saci酶将重组表达载体线性化，插入酵母dna基因组。

39、步骤（3）中，将感受态酵母宿主菌与线性化的重组表达载体混合，电激处理。具体的，冰浴后电击；电击参数：电压为1000-1500v，电容为20-30μf，电阻为150-250ω。优选的，电压为12000v，电容为25μf，电阻为200ω。电击后加入山梨醇溶液。

40、步骤（3）中，用博来霉素zeocin和甲醇筛选阳性转化子。

41、本发明的一个优选方案，将seq id no. 5的序列插入酵母宿主菌。

42、上述酵母工程菌或者其发酵产物可用于制备抗冻蛋白。

43、一种制备抗冻蛋白的方法，步骤包括：将上述酵母工程菌在含有甲醇的bmm培养基中进行发酵，27-29℃下培养68-75h。

44、进一步，将上述酵母工程菌在含有1.4%-1.6%体积浓度甲醇的bmm培养基中进行发酵，27-29℃下培养68-75h，并且每18-30h按1.4%-1.6%体积比，向培养基中添加甲醇。在200-500rpm和ph=5.5-6.5条件下培养。

45、本发明的优选方案，在含1.5%（v/v）甲醇的bmm培养基中，28-29℃条件下培养72h，并且每24h按1.5%体积比向培养基中添加甲醇；并且，在240-300rpm和ph=6.0条件下培养。

46、上述抗冻蛋白或者酵母工程菌的发酵产物可用于制备细胞冷冻保存液、冷冻保鲜剂或者冷冻食品。

47、酵母工程菌发酵后取发酵上清液，可直接用于制备细胞冷冻保存液、冷冻保鲜剂或者冷冻食品，或者纯化获得抗冻蛋白后制备细胞冷冻保存液、冷冻保鲜剂或者冷冻食品。

48、本发明的有益效果在于，通过人工合成抗冻蛋白基因序列，并进行表达，获得了一种新的抗冻蛋白。这种蛋白可以显著提高细胞冻存后复苏的存活率，减少细胞损伤。

49、通过构建抗冻蛋白重组表达载体，将抗冻蛋白基因转入酵母中。该菌株能够表达具有高活性的重组抗冻蛋白。所获得重组蛋白替代dmso添加到细胞冻存液中，通过检测冻存细胞复苏后的存活率，发现添加重组蛋白hhafp的冻存细胞复苏存活率比常规添加dmso的冻存细胞高。

50、并且通过优化表达条件，大幅度提高重组抗冻蛋白的产量，使酵母工程菌的发酵液中，重组抗冻蛋白的含量达到527mg/l。而且重组抗冻蛋白比例高，杂蛋白和其他杂质少。

51、通过本发明能够得到高活性、高产量的抗冻蛋白，为抗冻蛋白的多方面应用提供了良好的基础；本发明通过毕赤酵母高产量表达具有活性的抗冻蛋白，为实现抗冻蛋白的产业化提供了技术途径。