一种合成P34HB3HP的菌株及其构建方法和应用与流程

本发明涉及生物工程领域，特别涉及一种合成p34hb3hp的菌株及其构建方法和应用。

背景技术：

1、生物可降解聚合物在现代可持续发展的背景下具有极大的潜力，能够替代传统塑料，减少对环境的负面影响。聚羟基脂肪酸酯（简称pha）是一类由羟基脂肪酸作为单体组成的生物聚酯。作为一种生物可降解塑料，pha具有从刚性材料到弹性体的性能，可应用于各种包装材料和日常消费用塑料制品以及纺织纤维等。共聚物中单体种类的不同以及其比例的不同，给pha结构变化带来了无限可能，赋予了pha性能的多样化，如聚（3-羟基丁酸酯）（简称p3hb）、聚（3-羟基丁酸酯- co-4-羟基丁酸酯（简称p34hb）等，属于双聚物类型，这些双聚物聚合物在性能上存在一些限制，例如裂时延伸能力较低、材料易碎、韧性较差以及在高温下熔化不稳定等，因此在生物降解材料使用中具有一定的局限。

2、因此，亟需一种能够提高材料热力学性能和机械性能、生物相容好、降低生产成本、提高生产效率的方法。

技术实现思路

1、针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种合成聚（3-羟基丁酸- co-4-羟基丁酸- co-4-羟基丙酸）（p34hb3hp）的菌株及其构建方法和应用。

2、本发明提供一种合成聚（3-羟基丁酸- co-4-羟基丁酸- co-4-羟基丙酸）的菌株的构建方法，包括如下步骤：

3、s1：体外扩增 xylb- xyld- kivd- yqhd目的基因序列，插入载体中，得到载体质粒；

4、s2：体外扩增 ppda-ppdc-ppdb-aldd-orfz目的基因序列，插入载体中，得到载体质粒；

5、s3：体外扩增 dhab1- dhab2- dhab3- gdra-gdrb- pdup- phac目的基因序列，插入载体中，得到载体质粒；

6、s4：将s1、s2和s3所述载体质粒共同导入菌株中；

7、所述菌株为。

8、本申请中使用的菌株已于2021年8月2日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（简称gdmcc地址：广州市先列中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编510070）。保藏号为gdmcc no:61850。菌株名称为，分类命名为盐单胞菌（ halomonas lutescens）。

9、进一步的，所述步骤s1使用的载体为pseva321，步骤s2使用的载体为pseva341，步骤s3使用的载体为prsf。

10、进一步的，所述步骤s1、s2和s3中目的基因序列的扩增程序为：

11、（1）预变性：温度95℃，时间3 min；

12、（2）变性：温度95℃，时间15 sec；

13、（3）退火：温度56~60℃，时间15 sec；

14、（4）延伸：温度72℃，时间30~60 sec/kb；

15、（5）步骤（2）~（4）循环35次；

16、（6）彻底延伸：温度72℃，时间5 min。

17、本发明还提供一种合成聚（3-羟基丁酸- co-4-羟基丁酸- co-4-羟基丙酸）的菌株，所述的构建方法得到。

18、本发明还提供一种使用所述的菌株合成聚（3-羟基丁酸- co-4-羟基丁酸- co-4-羟基丙酸）的方法，包括如下步骤：（1）菌种活化后进行一级、二级种子培养，获得种子液；

19、（2）将种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养。

20、进一步的，所述步骤（2）中发酵培养的温度为36~38℃，ph为8.2~8.5，时间为45~50h。

21、进一步的，所述步骤（2）中发酵培养基包括如下组分：甘油10 g/l、木糖10 g/l、葡萄糖10 g/l、氯化钠50 g/l、酵母粉1.2 g/l、尿素0.2~3 g/l、无水硫酸镁0.2 g/l、磷酸二氢钾1.5~5.5 g/l、fe(iii)-nh4-citrate 5 g/l、cacl2·2h2o 2 g/l、hcl 12 mol/l、znso4·7h2o 0.1 g/l、mncl2·4h2o 0.03 g/l、、cocl2·6h2o 0.2 g/l、cuso4·5h2o 0.01 g/l、nicl2·6h2o 0.02 g/l、namoo4·2h2o 0.03 g/l。

22、综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：

23、（1）本发明的重组菌利用自身能生产3hb的特性，引入生产4hb和3hp的代谢途径，合成p34hb3hp三聚合物，提高了聚合物单体的应用领域。

24、（2）本发明的p34hb3hp为三聚合物，与传统双聚合物相比，分子量高，具有更强的热学性能更强和机械性能。

25、（3）本发明利用重组菌发酵生产p34hb3hp，生产工艺简单，实现高效可控的聚合物生产。

技术特征：

1.一种合成聚（3-羟基丁酸-co-4-羟基丁酸-co-4-羟基丙酸）的菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤s1使用的载体为pseva321，步骤s2使用的载体为pseva341，步骤s3使用的载体为prsf。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤s1、s2、s3中目的基因序列的扩增程序为：

4.一种合成聚（3-羟基丁酸-co-4-羟基丁酸-co-4-羟基丙酸）的菌株，其特征在于，由权利要求1~3任一项所述的构建方法得到。

5.一种使用权利要求4所述的菌株合成聚（3-羟基丁酸-co-4-羟基丁酸-co-4-羟基丙酸）的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）菌种活化后进行一级、二级种子培养，获得种子液；

6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中发酵培养的温度为36~38℃，ph为8.2~8.5，时间为45~50 h。

7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中发酵培养基包括如下组分：甘油10 g/l、木糖10 g/l、葡萄糖10 g/l、氯化钠50 g/l、酵母粉1.2 g/l、尿素0.2~3 g/l、无水硫酸镁0.2 g/l、磷酸二氢钾1.5~5.5 g/l、fe(iii)-nh4-citrate 5 g/l、cacl2·2h2o 2 g/l、hcl 12 mol/l、znso4·7h2o 0.1 g/l、mncl2·4h2o 0.03 g/l、、cocl2·6h2o 0.2 g/l、cuso4·5h2o 0.01 g/l、nicl2·6h2o 0.02 g/l、namoo4·2h2o 0.03g/l。

技术总结
本发明公开了一种合成P34HB3HP的菌株及其构建方法和应用。所述菌株的构建方法包括如下步骤：S1：体外扩增xylB‑xylD‑Kivd‑Yqhd目的基因序列，插入载体中，得到载体质粒；S2：体外扩增ppdA‑ppdC‑ppdB‑aldD‑orfZ目的基因序列，插入载体中，得到载体质粒；S3：体外扩增dhaB1‑dhaB2‑dhaB3‑gdrA‑gdrB‑PduP‑PhaC目的基因序列，插入载体中，得到载体质粒；S4：将S1、S2和S3所述载体质粒共同导入菌株中。本发明的方法能够高效生产热学性能和机械性能优良的P34HB3HP材料，可将其作为生物降解材料使用。

技术研发人员：叶健文,吕金艳,司徒卫,余柳松,林艺娜
受保护的技术使用者：珠海麦得发生物科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15