本发明涉及生物，具体涉及一种光果甘草干细胞的制备方法及用途。
背景技术：
1、光果甘草(glycyrrhizaglabra)为豆科(leguminosae)甘草属(glycyrrhiza)的多年生草本植物，是最古老的药材之一，传统上用于治疗咳嗽、支气管炎、急性腹痛和哮喘，甘草含有多种天然活性成分，如光甘草定、甘草苷、异甘草苷、甘草酸、甘草素等。化妆品中添加了光果甘草提取物具有美白、抗炎、抗氧化和保湿等功效，富含多种天然活性成分的光果甘草被广泛用于制药、化妆品和食品行业。光甘草定是从甘草根部提取的天然化合物，可以通过显著抑制酪氨酸酶活性和清除自由基达到美白肌肤的功效，是公认最安全的祛斑美白成分，也是世界上最昂贵的天然祛斑美白成分，享有“美白黄金”称号。
2、光果甘草有广泛的需求领域造成了对光果甘草消费的增加，虽然通过人工驯化的种植的方式可缓解对光果甘草消费的需求，但人工栽培光果甘草存在生长周期长、次生代谢产物含量低，并且产量和品质不稳定，有农残风险。对于这类生境特殊、培育周期长的植物来说，植物细胞培养是获取次生代谢产物相对可行的选择，但传统的愈伤组织细胞培养，因长期培养会出现衰退、褐化等现象限制了其大规模工业化生产，而植物干细胞具有生长周期短、培养条件可控、环境友好和目标次生代谢产物含量高且稳定等特点。通过培养光果甘草干细胞株系，可以实现大规模的生产和供应稳定的光果甘草成分，开发具有护肤功效的原料成分，提供天然、高效和温和的护肤品选项，满足消费者对于美白和舒缓皮肤的需求。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本发明提供一种光果甘草干细胞培养方法，该方法培养得到的光果甘草干细胞具有高含量的光甘草定，且最终的冻干粉能做为具有护肤功效优益的原料成分。
2、具体的，一方面，本发明提供了一种光果甘草干细胞培养方法，采用以下步骤制得：1)诱导培养；2)继代培养；3)生物反应器培养；其特征在于，所述诱导培养是将光果甘草的根尖接种于含吲哚乙酸(iaa)和吲哚-3-丁酸(iba)的b5培养基进行暗培养。
3、另一方面，本发明提供了一种光果甘草干细胞培养方法，采用以下步骤制得：1)诱导培养；2)继代培养；3)生物反应器培养；其特征在于，所述继代培养是将诱导分离出来的光果甘草细胞用含2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)的b5培养基和含吲哚乙酸(iaa)和吲哚-3-丁酸(iba)的b5培养基进行交替暗培养。
4、还在一方面，本发明提供了一种光果甘草干细胞培养方法，采用以下步骤制得：1)诱导培养；2)继代培养；3)生物反应器培养；其特征在于，所述生物反应器培养是将光果甘草干细胞转移至生物反应器内，用含有大豆苷元、吲哚乙酸(iaa)和吲哚-3-丁酸(iba)的b5液体培养基进行培养。
5、在这些方法的一些实施例中，所述诱导培养是将光果甘草的根尖接种于含吲哚乙酸(iaa)和吲哚-3-丁酸(iba)的b5培养基进行暗培养；其中，吲哚乙酸(iaa)和吲哚-3-丁酸(iba)的质量比为1：0.1～10。
6、在这些方法的一些实施例中，所述诱导培养是将光果甘草的根尖接种于含吲哚乙酸(iaa)和吲哚-3-丁酸(iba)的b5培养基进行暗培养；其中，吲哚乙酸(iaa)和吲哚-3-丁酸(iba)的质量比为1：0.8～1.2。
7、在这些方法的一些实施例中，所述诱导培养是将光果甘草的根尖接种于含吲哚乙酸(iaa)和吲哚-3-丁酸(iba)的b5培养基进行暗培养；其中，吲哚乙酸(iaa)和吲哚-3-丁酸(iba)的质量比为1：1。
8、在这些方法的一些实施例中，所述诱导培养是将光果甘草的根尖接种于含吲哚乙酸(iaa)和吲哚-3-丁酸(iba)的b5培养基进行暗培养；其中，吲哚乙酸(iaa)浓度是0.1-10mg/l，吲哚-3-丁酸(iba)浓度是0.1-10mg/l。
9、在这些方法的一些实施例中，所述诱导培养是将光果甘草的根尖接种于含吲哚乙酸(iaa)和吲哚-3-丁酸(iba)的b5培养基进行暗培养；其中，吲哚乙酸(iaa)浓度是1-3mg/l，吲哚-3-丁酸(iba)浓度是1-3mg/l。
10、在这些方法的一些实施例中，所述诱导培养是将光果甘草的根尖接种于含吲哚乙酸(iaa)和吲哚-3-丁酸(iba)的b5培养基进行暗培养；其中，吲哚乙酸(iaa)浓度是2mg/l，吲哚-3-丁酸(iba)浓度是2mg/l。
11、在这些方法的一些实施例中，所述诱导培养是将光果甘草的根尖接种于含吲哚乙酸(iaa)和吲哚-3-丁酸(iba)的b5培养基进行暗培养；其中，所述含吲哚乙酸(iaa)和吲哚-3-丁酸(iba)的b5培养基是包含0.1-10.0mg/l吲哚乙酸、0.1-10.0mg/l吲哚-3-丁酸、30-40g/l蔗糖、75-100mg/l抗坏血酸、150-200mg/l柠檬酸和7-10g/l琼脂的b5培养基，ph值5.8-6.2。
12、在这些方法的一些实施例中，所述诱导培养是将光果甘草的根尖接种于含吲哚乙酸(iaa)和吲哚-3-丁酸(iba)的b5培养基进行暗培养；其中，所述吲哚乙酸(iaa)和吲哚-3-丁酸(iba)的b5培养基是包含1-3mg/l吲哚乙酸、1-3mg/l吲哚-3-丁酸、30-40g/l蔗糖、75-100mg/l抗坏血酸、150-200mg/l柠檬酸和7-10g/l琼脂的b5培养基。
13、在这些方法的一些实施例中，所述诱导培养是将光果甘草的根尖接种于含吲哚乙酸(iaa)和吲哚-3-丁酸(iba)的b5培养基进行暗培养；其中，所述吲哚乙酸(iaa)和吲哚-3-丁酸(iba)的b5培养基是包含2mg/l吲哚乙酸、2mg/l吲哚-3-丁酸、30g/l蔗糖、75mg/l抗坏血酸、200mg/l柠檬酸和7g/l琼脂的b5培养基。
14、在这些方法的一些实施例中，所述诱导培养是将光果甘草无菌苗幼苗切取根尖并去除根冠，使用蔗糖溶液作为渗透剂进行浸泡处理，然后用无菌水冲洗，并用柠檬酸冲洗，将根尖接种于含吲哚乙酸(iaa)和吲哚-3-丁酸(iba)的b5培养基进行暗培养。
15、在这些方法的一些实施例中，所述诱导培养是将光果甘草无菌苗幼苗切取根尖并去除根冠，使用蔗糖溶液作为渗透剂进行浸泡处理，是使用0.5-0.8mol/l蔗糖溶液作为渗透剂进行浸泡20-30h处理。
16、在这些方法的一些实施例中，所述诱导培养是将光果甘草无菌苗幼苗切取根尖并去除根冠，使用0.6mol/l蔗糖溶液作为渗透剂进行浸泡24h处理。
17、在这些方法的一些实施例中，所述诱导培养是将光果甘草无菌苗幼苗切取根尖并去除根冠，用柠檬酸冲洗是使用150-250mg/l柠檬酸冲洗；优选地，使用200mg/l柠檬酸冲洗。
18、在这些方法的一些实施例中，所述继代培养是将诱导分离出来的光果甘草细胞用含2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)的b5培养基和含吲哚乙酸(iaa)和吲哚-3-丁酸(iba)的b5培养基进行交替暗培养；其中，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度是0.1-10.0mg/l，吲哚乙酸(iaa)的浓度是0.1-10.0mg/l，吲哚-3-丁酸(iba)的浓度是0.1-10.0mg/l。
19、在这些方法的一些实施例中，所述继代培养是将诱导分离出来的光果甘草细胞用含2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)的b5培养基和含吲哚乙酸(iaa)和吲哚-3-丁酸(iba)的b5培养基进行交替暗培养；其中，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度是1-3mg/l，吲哚乙酸(iaa)的浓度是1-3mg/l，吲哚-3-丁酸(iba)的浓度是1-3mg/l。
20、在这些方法的一些实施例中，所述继代培养是将诱导分离出来的光果甘草细胞用含2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)的b5培养基和含吲哚乙酸(iaa)和吲哚-3-丁酸(iba)的b5培养基进行交替暗培养；其中，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度是1.5mg/l，吲哚乙酸(iaa)的浓度是2mg/l，吲哚-3-丁酸(iba)的浓度是2mg/l。
21、在这些方法的一些实施例中，所述继代培养是将诱导分离出来的光果甘草细胞接入含0.1-10.0mg/l 2,4-二氯苯氧乙酸、30-40g/l蔗糖和7-10g/l琼脂的b5培养基，其ph值5.8-6.2，继代暗培养7-14天；再使用含0.1-10.0mg/l吲哚乙酸、0.1-10.0mg/l吲哚-3-丁酸、30-40g/l蔗糖、75-100mg/l抗坏血酸、150-200mg/l柠檬酸和7-10g/l琼脂的b5培养基交替培养7-14天。
22、在这些方法的一些实施例中，所述继代培养是将诱导分离出来的光果甘草细胞接入含1.5mg/l 2,4-二氯苯氧乙酸、30g/l蔗糖和7g/l琼脂的b5培养基，其ph值5.8-6.2，继代暗培养14天；再使用含2mg/l吲哚乙酸、2mg/l吲哚-3-丁酸、30g/l蔗糖、75mg/l抗坏血酸、200mg/l柠檬酸和7g/l琼脂的b5培养基交替培养14天。
23、在这些方法的一些实施例中，所述生物反应器培养是将光果甘草干细胞转移至生物反应器内，用含有大豆苷元、吲哚乙酸(iaa)和吲哚-3-丁酸(iba)的b5液体培养基进行培养；其中，大豆苷元的浓度是4-8mg/l、吲哚乙酸的浓度是0.1-10.0mg/l、吲哚-3-丁酸的浓度是0.1-10.0mg/l；
24、在这些方法的一些实施例中，所述生物反应器培养是将光果甘草干细胞转移至生物反应器内，用含有大豆苷元、吲哚乙酸(iaa)和吲哚-3-丁酸(iba)的b5液体培养基进行培养；其中，大豆苷元的浓度是4-6mg/l、吲哚乙酸的浓度是1-3mg/l、吲哚-3-丁酸的浓度是1-3mg/l。
25、在这些方法的一些实施例中，所述生物反应器培养是将光果甘草干细胞转移至生物反应器内，用含有大豆苷元、吲哚乙酸(iaa)和吲哚-3-丁酸(iba)的b5液体培养基进行培养；其中，大豆苷元的浓度是5mg/l、吲哚乙酸的浓度是2mg/l、吲哚-3-丁酸的浓度是22mg/l。
26、在这些方法的一些实施例中，所述生物反应器培养是将光果甘草干细胞转移至生物反应器内，用含有大豆苷元、吲哚乙酸(iaa)和吲哚-3-丁酸(iba)的b5液体培养基进行培养；其中，含有大豆苷元、吲哚乙酸(iaa)和吲哚-3-丁酸(iba)的b5液体培养基为含有5mg/l大豆苷元、0.1-10.0mg/l吲哚乙酸、0.1-10.0mg/l吲哚-3-丁酸、30-40g/l蔗糖、75-100mg/l抗坏血酸、150-200mg/l柠檬酸和7-10g/l琼脂的b5液体培养基，ph值5.8-6.2。
27、在这些方法的一些实施例中，所述生物反应器培养是将光果甘草干细胞转移至生物反应器内，用含有大豆苷元、吲哚乙酸(iaa)和吲哚-3-丁酸(iba)的b5液体培养基进行培养；其中，含有大豆苷元、吲哚乙酸(iaa)和吲哚-3-丁酸(iba)的b5液体培养基为含有5mg/l大豆苷元、1-3mg/l吲哚乙酸、1-3mg/l吲哚-3-丁酸、30g/l蔗糖、75mg/l抗坏血酸、200mg/l柠檬酸和7g/l琼脂的b5液体培养基，ph值5.8-6.2。
28、在这些方法的一些实施例中，所述生物反应器培养是将光果甘草干细胞转移至生物反应器内培养，培养液是含有大豆苷元(5mg/l)、吲哚乙酸(2.0mg/l)、吲哚-3-丁酸(2.0mg/l)、蔗糖(30g/l)、抗坏血酸(75mg/l)、柠檬酸(200mg/l)和琼脂(7g/l)的b5液体培养基，ph值5.8-6.2，在co2培养箱中以35-45r·min-1的转速搅拌培养，培养至第4-6d，收获扩增培养的光果甘草干细胞。
29、在这些方法的一些实施例中，在诱导培养前，光果甘草幼苗采用如下方式获取：挑选饱满的光果甘草种子进行200mg/l ga3浸泡处理24h后，置于超净工作台上，用75％的酒精浸泡消毒2min，无菌水冲洗3-4次；7.5％次氯酸钠浸泡1min，1％次氯酸钠浸泡15min，无菌水冲洗4-5次，无菌滤纸擦干水分，接种到ms基本培养基(ph值5.8-6.2)，培养温度为(27±2)℃，暗培养3d后，置于12h/d光照，2500lx光强中继续培养。
30、在这些方法的一些实施例中，培养温度保持在(27±2)℃。
31、有益效果
32、相比现有技术，本发明的某一个实施例具有至少一个以下的有益效果：
33、(1)本发明进行光果甘草干细胞的分离制备培养，实现光果甘草干细胞的诱导和大规模培养，突破了传统愈伤组织培养中培养物对剪切力敏感、次生代谢产物低、遗传不稳定等关键技术瓶颈。
34、(2)本发明通过对光果甘草干细胞放大培养、提取和冻干处理，成功获得了光果甘草干细胞冻干粉，为护肤品的研发与生产提供新的原料来源和技术支持。
35、术语说明
36、现在详细描述本发明的某些实施方案。本发明意图涵盖所有的替代、修改和等同技术方案，它们均包括在如权利要求定义的本发明范围内。本领域技术人员应认识到，许多与本文所述类似或等同的方法和材料能够用于实践本发明。本发明绝不限于本文所述的方法和材料。在所结合的文献、专利和类似材料的一篇或多篇与本技术不同或相矛盾的情况下(包括但不限于所定义的术语、术语应用、所描述的技术，等等)，以本技术为准。
37、应进一步认识到，本发明的某些特征，为清楚可见，在多个独立的实施方案中进行了描述，但也可以在单个实施例中以组合形式提供。反之，本发明的各种特征，为简洁起见，在单个实施方案中进行了描述，但也可以单独或以任意适合的子组合提供。
38、除非另外说明，本发明所使用的所有科技术语具有与本发明所属领域技术人员的通常理解相同的含义。本发明涉及的所有专利和公开出版物通过引用方式整体并入本发明。
39、在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
40、在下面的内容中，无论是否使用“大约”或“约”等字眼，所有在此公开了的数字均为近似值。每一个数字的数值有可能会出现1％、2％、5％、7％、8％、10％、15％或20％等差异。每当公开一个具有n值的数字时，任何具有n+/-1％,n+/-2％,n+/-3％,n+/-5％,n+/-7％,n+/-8％,n+/-10％,n+/-15％或n+/-20％值的数字会被明确地公开,其中“+/-”是指加或减。