一种提高天敌昆虫抗药性的方法

本发明属于天敌昆虫基因编辑，尤其涉及一种提高天敌昆虫抗药性的方法。

背景技术：

1、农业害虫生物防治在可持续发展中起着极其重要的作用，七星瓢虫(coccinellaseptempunctata)鞘翅目瓢虫科，具有：食性广、食量大、分布广、繁殖能力强等一系列优点，是一种具有优势的捕食性天敌昆虫。蚜虫是一类广泛发生、严重为害的农林害虫，是瓢虫与草蛉等天敌昆虫的主要捕食对象。目前田间大多使用吡虫啉等有机磷类杀虫剂来防治蚜虫。然而随着近些年来田间农药的不断使用，在消灭害虫的同时，还会大量杀伤天敌昆虫。容易导致害虫死灰复燃、次级害虫爆发、食物链毒性、亚致死效应等一系列不利于影响。天敌昆虫与农药兼容性差的问题，即释放天敌昆虫时不能立即喷施农药，喷施农药后也不能立即释放天敌昆虫，严重制约了天敌昆虫的应用。

2、crispr-cas9技术作为第三代基因编辑技术，根据cas序列的不同，被分为ⅰ型、ⅱ型和ⅲ型；ⅱ型组成成分简单，由crrna，tracrna和cas9蛋白三部分组成，其中crrna和tracrna能形成二聚体，又能与cas9蛋白形成复合物，二聚体识别pam位点前的靶序列。cas9蛋白有ruvc和hnh内切酶结构域，ruvc能切割靶序列，hnh切割pam位点，导致形成断裂双链(dsbs)，其可引发形成同源重复(hdr)修复机制和非同源末端连接(nhej)修复机制。可以基于简单的核苷酸互补配对方式结合在基因组靶位点实现定点突变、敲除突变等。理论上，借助crispr-cas9技术可以实现序列的敲除与敲入，敲入是将外源序列或基因整合到靶位点，敲除是在靶位点实现少数碱基的插入、删除或替换，改变编码蛋白的一级结构，破坏蛋白质的功能。但是能否实现，与涉及的基因、物种相关，更需要实验验证。

3、目前，尚未有利用crispr-cas9技术提高天敌昆虫抗药性的有效方法。要增强天敌昆虫的抗药性，常规的思路是在天敌昆虫基因组中插入耐药基因，但这一点目前难以实现。

技术实现思路

1、鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种提高天敌昆虫抗药性的方法。

2、本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

3、本发明提供一种提高天敌昆虫抗药性的方法，包括以下步骤：利用crispr-cas9技术敲除或部分敲除天敌昆虫药物受体靶标位点。

4、本发明的有益效果包括：

5、本发明创造性地借助crispr-cas9技术，选择昆虫的乙酰胆碱受体为靶标，对其进行敲除，抑制神经信号的传递，降低昆虫对农药的敏感性，从而提高天敌昆虫对农药的抗性，具有实验过程简单、耗时短和工作量小等优势。

6、进一步，利用crispr-cas9技术敲除或部分敲除天敌昆虫烟碱型乙酰胆碱受体基因。

7、采取上述技术方案的有益效果包括：本发明利用crispr-cas9技术对天敌昆虫乙酰胆碱受体基因进行突变，使得突触部位不会大量积累乙酰胆碱，降低昆虫对农药的敏感性，从而提高了天敌昆虫对有机磷农药的抗性，有利于天敌昆虫在生物防治中的应用。

8、进一步，包括以下步骤：制备grna和cas9蛋白的混合物，grna用于指导cas9蛋白对靶标位点的识别，对天敌昆虫的卵进行显微注射混合物。

9、进一步，grna制备方法包括以下步骤：将grna的dna模板序列经体外转录，获得grna。所述grna包括grna1、grna2、grna3中的一种或几种的组合。

10、进一步，grna的dna模板序列由t7启动子序列、编码靶特异性grna的序列和crrna/tracrrna恒定区组成；t7启动子序列为taatacgactcactatag；crrna/tracrrna恒定区的序列为gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttt。

11、其中，grna1的dna模板序列包括seq id no:7所示的核苷酸序列；grna2的dna模板序列包括seq id no:8所示的核苷酸序列；grna3的dna模板序列包括seq id no:9所示的核苷酸序列。

12、进一步，grna的dna模板制备方法包括以下步骤：利用pcr组装grna的dna模板；pcr组装体系包括靶向引物混合工作液和tracr片段+t7引物混合物；

13、靶向引物混合工作液包括靶向正向引物和靶向反向引物，靶向正向引物包括：taatacgactcactatag+目标序列16–20nt；靶向反向引物包括：ttctagctctaaaac+目标反向互补序列19-20nt；

14、tracr片段+t7引物混合物包括通用正向引物、通用反向引物和crrna/tracrrna恒定区，通用正向引物的序列为taatacgactcactatag(seq id no:10)，通用反向引物的序列为ttctagctctaaaac(seq id no:11)，crrna/tracrrna的恒定区的序列为gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtcc gttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttt(seq idno:5)。

15、其中，grna1的dna模板制备方法包括以下步骤：利用pcr组装grna1的dna模板；grna1的pcr组装体系包括靶向引物混合工作液和tracr片段+t7引物混合物。

16、tracr片段+t7引物混合物包括通用正向引物、通用反向引物和crrna/tracrrna的恒定区；通用正向引物的序列为包括seq id no:10所示的核苷酸序列；通用反向引物的序列包括seq id no:11所示的核苷酸序列；crrna/tracrrna的恒定区包括seq id no:5所示的核苷酸序列。

17、grna1的靶向引物混合工作液包括靶向正向引物1和靶向反向引物1；靶向正向引物1的序列包括seq id no:12所示的核苷酸序列，靶向反向引物1的序列包括seq id no:13所示的核苷酸序列。

18、pcr反应体系包括：pcr反应液、tracr片段+t7引物混合物、grna1的靶向引物混合工作液和水。pcr反应条件包括：预变性98℃10s；变性98℃5s、退火55℃15s，32个循环；延伸72℃60s。

19、grna2的dna模板制备方法、grna3的dna模板制备方法均参照grna1的dna模板制备方法。

20、与grna1的dna模板制备方法不同之处在于，用于组装grna2的dna模板的靶向引物分包括靶向正向引物2和靶向反向引物2；靶向正向引物2的序列包括seq id no:14所示的核苷酸序列，靶向反向引物2的序列包括seq id no:15所示的核苷酸序列。

21、与grna1的dna模板制备方法不同之处在于，用于组装grna3的dna模板的靶向引物包括靶向正向引物3和靶向反向引物3；靶向正向引物3的序列包括seq id no:16所示的核苷酸序列，靶向反向引物3的序列包括seq id no:17所示的核苷酸序列。

22、采取上述技术方案的有益效果包括：采用上述方法可以实现利用crispr-cas9技术敲除天敌昆虫药物受体靶标位点，其中，grna1获得突变体抗药性提高的更显著。经实验验证，利用grna1进行经过crispr-cas9系统突变得到突变体系抗药性提升了16.173倍，死亡率明显降低。

23、进一步，显微注射的条件包括：注射压力为1200hpa，注射时间为0.1s，补偿压力为25hpa，从产卵到注射在2h内完成，注射角度为45°。

24、采取上述技术方案的有益效果包括：在该显微注射条件下，注射时针可以有效地将混合物注入卵中，减少对卵的破坏，提高孵化率，实现高效的基因编辑。从产卵到注射在2h内完成，从产卵到注射的时间应比较短，有利于提高突变率。

25、进一步，grna与cas9蛋白的摩尔比为1.5：1。

26、采取上述技术方案的有益效果包括：当摩尔比grna：cas9蛋白＝1.5：1时，能够使得瓢虫幼虫发生突变。

27、进一步，所述天敌昆虫卵经显微注射后，撒上淀粉，放置温度为25±3℃，湿度为60-70％，光周期为l：d＝16：8的光照培养箱进行孵化。

28、采取上述技术方案的有益效果包括：将grna和cas9蛋白方便快捷地注入卵中，实现高效的基因编辑，在上述条件下培养，可以提高卵的孵化率。

29、进一步，还包括检测敲除突变体的步骤。

30、采用上述方案的有益效果包括：通过检测步骤，可以对敲除突变体进行筛选。

31、本发明提供一种用于提高天敌昆虫抗药性的试剂盒，包括grna、用于组装grna的dna模板的靶向引物混合工作液中的一种或几种，所述grna通过cri spr-cas9技术敲除或部分敲除天敌昆虫药物受体靶标位点。

32、采取上述技术方案的有益效果包括：通过上述试剂盒可以实现利用cri spr-cas9技术敲除乙酰胆碱受体，从而抑制神经信号的传递，降低昆虫对农药的敏感性，进一步提高天敌昆虫对农药的抗性，具有实验过程简单、耗时短和工作量小等优势。

33、进一步，所述试剂盒还包括pcr反应液、tracr片段+t7引物混合物、水、体外转录用试剂、纯化体外转录产物试剂、cas9蛋白中的一种或几种。

34、进一步，所述grna包括grna1、grna2、grna3中的一种或几种的组合。

35、grna1的dna模板序列包括seq id no:7所示的核苷酸序列；grna2的dna模板序列包括seq id no:8所示的核苷酸序列；grna3的dna模板序列包括seq id no:9所示的核苷酸序列。

36、用于组装grna的dna模板的靶向引物混合工作液包括用于组装grna1的dna模板的靶向引物混合工作液、用于组装grna2的dna模板的靶向引物混合工作液、用于组装grna3的dna模板的靶向引物混合工作液中的一种或几种。

37、用于组装grna1的dna模板的靶向引物混合工作液包括靶向正向引物1和靶向反向引物1；靶向正向引物1的序列包括seq id no:12所示的核苷酸序列，靶向反向引物1的序列包括seq id no:13所示的核苷酸序列。

38、用于组装grna2的dna模板的靶向引物混合工作液包括靶向正向引物2和靶向反向引物2；靶向正向引物2的序列包括seq id no:14所示的核苷酸序列，靶向反向引物2的序列包括seq id no:15所示的核苷酸序列。

39、用于组装grna3的dna模板的靶向引物混合工作液包括靶向正向引物3和靶向反向引物3；靶向正向引物3的序列包括seq id no:16所示的核苷酸序列，靶向反向引物3的序列包括seq id no:17所示的核苷酸序列。

40、采取上述技术方案的有益效果包括：采用上述试剂盒可以实现利用crispr-cas9技术敲除天敌昆虫药物受体靶标位点，其中，grna1获得突变体抗药性提高的更显著。经实验验证，利用grna1进行经过crispr-cas9系统突变得到突变体系抗药性提升了16.173倍，死亡率明显降低。