α1,2-岩藻糖基转移酶突变体及表达其的重组大肠杆菌和应用的制作方法

本发明涉及生物，尤其是涉及一种α1,2-岩藻糖基转移酶突变体及表达其的重组大肠杆菌和应用。

背景技术：

1、母乳低聚糖(human milk oligosaccharides，hmos)是母乳中一类独特的游离型低聚糖，在母乳中的含量仅次于水、乳糖和脂肪，是母乳中第三大固体成分，被认为是天然母乳和人工配方奶粉的重要区别。因为它们几乎是母乳喂养婴儿的益生元的唯一来源，对新生儿的生长有许多重要的健康影响。例如，它们可以通过塑造肠道微生物群，促进双歧杆菌增殖，发挥独特的健康效应，包括调节肠上皮细胞应答、抗粘附抗菌抗病毒，抵抗致病性微生物感染、预防坏死性小肠结肠炎，调节免疫反应、改善大脑发育和认知等。因此，近年来hmos引起了广泛的商业关注。其中，一些hmos组分，如lnt(乳糖-n-四糖)、lnnt(乳糖-n-新四糖)、2'-fl(2'-岩藻糖基乳糖)、3'-fl(3'-岩藻糖基乳糖)、3'-sl(3'-唾液酸乳糖)和6'-sl(6'-唾液酸乳糖)已被已经被美国fda批准为“公认的安全(gras)”的食品，并允许商业化生产和添加到婴儿配方奶粉中。

2、2'-岩藻糖基乳糖(2'-fl)是母乳中含量最丰富、最早商业化的一个hmo结构，也是当下所有hmos中最受关注的组分，目前已获得美国、欧盟、澳大利亚和亚太地区多个监管机构的批准，主要应用于婴儿配方奶粉、营养食品和食品添加剂。目前，已经报导了四种方法，包括母乳分离、化学合成、酶促合成和微生物发酵，被用于2'-fl的合成研究。前三种传统的生产方法存在原料或底物来源有限、价格昂贵，且生产工艺复杂，不够经济环保等因素，目前均不适用于2'-fl的规模化生产。随着合成生物学和代谢工程技术的快速发展，使得通过微生物构建细胞工厂日益易于操作，促进了微生物合成2'-fl的各种策略的发展，这已被证明是一种很有前途并被广泛采用的方法。

3、大肠杆菌因其快速生长、遗传背景清晰易改造，且易于扩大培养，已成为hmos合成的首选微生物宿主。目前通过多种代谢工程策略，包括模块化途径优化与构建、辅因子供应优化和底盘微生物修饰等等，大肠杆菌已被开发为2'-fl的主要生产者，但目前相对较低的产量和高生产成本仍然是2'-fl工业化生产中亟待改善的问题。

4、一般来说，对于2'-fl的微生物合成，需要考虑三个关键要素：供体gdp-l-岩藻糖、受体乳糖和α1,2-岩藻糖基转移酶(ft)。α1,2-ft能将l-岩藻糖基从供体转移到受体的半乳糖基上，催化合成2'-fl。供体gdp-l-岩藻糖的主流生产方法是从头合成，主要以糖酵解的重要中间体6-磷酸果糖为起点，经过五个酶促级联步骤(mana[甘露糖-6-磷酸异构酶]，manb[磷酸甘露糖变位酶]，manc[α-d-甘露糖1-磷酸鸟嘌呤基转移酶]，gmd[gdp-甘露糖4,6-脱氢酶]和wcag[gdp-l-岩藻糖合成酶])催化合成，参见图1。通常利用高拷贝数质粒过表达这五个基因，以及阻断竞争性代谢途径的关键酶(wcaj)来强化gdp-l-岩藻糖的供应水平。乳糖是一种常见碳源，价格相对低廉，因此通常直接外源添加到反应体系中，作为底物使用。为了减少乳糖的降解损失，通常需要阻断底盘宿主的乳糖分解代谢途径。在2'-fl的微生物合成途径中，α1,2-ft是关键限速步骤之一。此前，有多个研究小组已经成功从不同细菌中克隆并鉴定了几种具有良好催化活性的α1,2-fts，如幽门螺杆菌来源的futc、大肠杆菌o126来源的wbgl、脆弱拟杆菌来源的wcfb、螺杆菌11s02629-2来源的bkht、生脂固氮螺菌来源的samt。尽管如此，这些基因在大肠杆菌中活性表达水平通常很低，导致催化性能低效，而且均来源于病原微生物，对食品生产安全性具有潜在的威胁，一定程度上限制了它们在2'-fl合成中的应用，同时也为在不同国家申请2'-fl的生产和应用埋下了潜在的障碍。另外，这些α1,2-fts还能产生3-fl和/或dfl等副产物，导致底物特异性较低，这为下游的纯化过程带来了新的挑战。因此，寻找高活性且高特异性的α1,2-ft基因对于2'-fl的高效生产具有重大意义，最好是来自于人类胃肠道中的安全微生物。

5、到目前为止，利用高拷贝质粒对参与从头合成途径的基因进行过表达是提高2'-fl产量的常用措施，绝大部分全细胞合成2'-fl的方法都依赖于所携带的质粒来表达目的基因。重组质粒对于单基因的克隆和短期表达是有利的，但在利用细菌宿主细胞合成次级代谢产物时一般需要对多个途径基因进行共表达，这种情况下使用质粒表达系统往往存在一些不可避免的稳定性缺陷。一方面，质粒在细胞增殖过程中具有结构和分离不稳定性，这可能导致目的基因的丢失或表达失活；其次，为了在细胞中维持表达质粒的遗传，通常需要添加选择标记，如抗生素抗性基因，这种选择系统导致生产成本的增加，同时由于抗生素的使用在食品安全生产上受法律限制，导致下游的纯化提取工艺成本又增加；另外，高拷贝质粒复制时产生的代谢负担和某些基因的强烈过表达可能导致生长速度降低，导致胞内代谢通量和能量分布的失衡，进而影响目标产物的合成。因此，开发安全稳定、环境友好、经济高效的2'-fl合成方法成为了必然的趋势。

6、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种α1,2-岩藻糖基转移酶突变体及表达其的重组大肠杆菌和应用，该突变体具有较高的岩藻糖基化活性和较高的底物特异性，不会形成副产物dfl和3-fl，以缓解上述中的至少一个技术问题。

2、为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

3、根据本发明的一个方面，提供了一种α1,2-岩藻糖基转移酶突变体，其具有如下氨基酸序列的片段：由seq id no.1所示氨基酸序列经如下一种突变或几种突变的组合后得到的序列：d66g、f101y、l128i、l136i、v138i、q205m、w224y和v232i。

4、根据本发明的另一个方面，还提供了一种生物材料，所述生物材料选自(ⅰ)～(ⅲ)中任一项：

5、(i)多核苷酸，含有编码上述的α1,2-岩藻糖基转移酶突变体的片段；

6、(ⅱ)载体，所述载体携带(ⅰ)中多核苷酸；

7、(ⅲ)细胞，所述细胞携带(ⅰ)中多核苷酸，或含有(ⅱ)中载体，或表达上述的α1,2-岩藻糖基转移酶突变体。

8、根据本发明的另一个方面，还提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌的染色体基因组中含有至少一个拷贝的糖基转移酶基因jagapm，每个所述糖基转移酶基因jagapm分别独立的编码上述的α1,2-岩藻糖基转移酶突变体。

9、根据本发明的另一个方面，还提供了上述的重组大肠杆菌的制备方法，该制备方法包括通过至少一种crispr/cas基因编辑系统，清除、下调和/或敲入大肠杆菌基因组染色体中的基因和/或启动子区域。

10、根据本发明的另一个方面，还提供了一种2'-岩藻糖基乳糖的制备方法，所述制备方法包括由表达上述的α1,2-岩藻糖基转移酶突变体的细胞发酵得到。

11、根据本发明的另一个方面，还提供了上述的α1,2-岩藻糖基转移酶突变体，或上述的生物材料，或上述的重组大肠杆菌，或上述的重组大肠杆菌的制备方法，或上述的制备方法在制备母乳低聚糖中的应用。

12、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

13、本发明对一个普雷沃氏菌来源的α1,2-岩藻糖基转移酶(jagap)进行多轮定点突变，最终获得了一株具有较高岩藻糖基化活性和较高底物特异性的α1,2-岩藻糖基转移酶突变体，能够高效实现将底物乳糖转化为2'-fl，而且不会形成副产物dfl和3-fl。

14、本发明通将α1,2-岩藻糖基转移酶突变体插入到大肠杆菌染色体上进行整合表达，以及在一些优选的实施方式中将从头合成的相关途径基因也插入到大肠杆菌染色体上进行整合表达，所获得的重组菌株相较于携带质粒表达的重组菌株，具有良好的遗传稳定性和生长状况。

15、本发明利用上述重组大肠杆菌在5l发酵罐中以甘油为碳源，乳糖为底物发酵生产2'-fl的产量可达到106.42g/l，单位生产效率可达到1.34g/l/h，该发酵水平高于现有技术水平，且在发酵过程中无需添加任何抗生素。因此，本发明的原材料廉价易得，无危害人体健康的添加剂，对后续产物提纯无不利影响，能够达到商业应用的要求。