梨转录因子PbrMYB65与PbrACO2基因启动子互作在调控果实柠檬酸异构化中的应用

本发明属于分子生物学和基因工程，具体涉及一种梨转录因子pbrmyb65通过调控柠檬酸代谢关键基因pbraco2的表达进而促进柠檬酸异构化。

背景技术：

1、梨是百果之宗；富含营养物质，深受全世界消费者的青睐。苹果酸和柠檬酸是果实中主要的有机酸，在果实风味品质形成过程中起着重要作用。

2、果实中有机酸的含量与其自身合成、降解以及区室化分布过程密切相关。对于园艺作物而言，位于细胞质中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvatecarboxylase，pepc)和线粒体中的柠檬酸合成酶(citrate synthase，cs)是柠檬酸生物合成的关键酶：磷酸烯醇式丙酮酸在pepc的作用下羧化生成草酰乙酸；后者进入线粒体后，在cs的催化作用下结合乙酰辅酶a(acetyl-coa，ac-coa)生成柠檬酸。然而，对低/高柠檬酸品种以及果实发育过程中cs和pepc酶活性及相关基因表达量进行分析发现，它们与柠檬酸含量之间无显著相关性。因此，果实中柠檬酸的积累可能主要受到下游降解途径的调控。

3、顺乌头酸酶(aconitases，acos)是一种含有4fe-4s簇的铁硫酶，催化柠檬酸的可逆异构化。植物acos定位于细胞质(cytacos)和线粒体(mytacos)中，主要参与柠檬酸异构化为顺乌头酸的过程。过表达水稻osaco1基因或柑橘citaco3基因抑制植物组织中柠檬酸的积累；另一方面，敲除水稻osaco1基因或沉默番茄slaco1基因则可促进了组织中柠檬酸的积累。

4、转录因子(transcription factor，tf)可与下游结构基因启动子中的顺势作用元件结合进而调控其表达，在植物的生长发育和逆境胁迫中发挥重要作用，主要包括wrkys、bzips和mybs等家族基因。puwrky31可与pusweet15启动子中的w-box元件结合，激活pusweet15的转录，进而促进‘南果’梨中可溶性糖的积累。citwrky1可与citnac62互做，协同调控柑橘中citaco3基因的表达，抑制果实中柠檬酸的积累。截止目前，参与梨果实柠檬酸代谢的aco基因家族成员及其调控机制还鲜有报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供pbraco2基因或与pbraco2基因相关的生物材料在调控蔷薇科果树的果实中柠檬酸异构化或调控蔷薇科果树的果实中柠檬酸积累中的应用。

2、本发明的另一目的在于提供myb家族转录因子pbrmyb65或与myb家族转录因子pbrmyb65相关的生物材料在调控蔷薇科果树的果实中柠檬酸异构化或调控蔷薇科果树的果实中柠檬酸积累中的应用。研究表明，myb家族转录因子pbrmyb65与pbraco2基因启动子互作能够调控梨果实柠檬酸积累。转录因子pbrmyb65能特异地结合于pbraco2基因上游启动子中的myb结合位点(p1：(-800)-(-795)；p2：(-203)-(-198))，促进pbraco2基因的转录。

3、本发明的又一目的在于提供一种抑制蔷薇科果树的果实中柠檬酸的积累的方法。

4、本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

5、第一方面，本发明请求保护pbraco2基因或与pbraco2基因相关的生物材料在调控蔷薇科果树的果实中柠檬酸异构化或调控蔷薇科果树的果实中柠檬酸积累中的应用，所述pbraco2基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。

6、进一步，与pbraco2基因相关的生物材料为(1)～(8)中的至少一种：

7、(1)氨基酸序列如seq id no.4所示的pbraco2蛋白；；

8、(2)含有所述pbraco2基因的表达盒；

9、(3)含有所述pbraco2基因的重组载体；

10、(4)含有(2)所述表达盒的重组载体；

11、(5)含有所述pbraco2基因的重组微生物；

12、(6)含有(2)所述表达盒的重组微生物；

13、(7)含有(3)所述重组载体的重组微生物；

14、(8)含有(4)所述重组载体的重组微生物。

15、进一步的，所述的pbraco2蛋白为由pbraco2基因编码的蛋白。

16、更进一步的，过表达所述的pbraco2基因抑制果实中柠檬酸积累，或促进柠檬酸异构化。

17、第二方面，本发明请求保护myb家族转录因子pbrmyb65或与myb家族转录因子pbrmyb65相关的生物材料在调控蔷薇科果树的果实中柠檬酸异构化或调控蔷薇科果树的果实中柠檬酸积累中的应用，所述转录因子pbrmyb65的氨基酸序列如seq id no.2所示。

18、进一步，与转录因子pbrmyb65相关的生物材料为以下(1)～(8)中的至少一种：

19、(1)编码所述转录因子pbrmyb65的基因pbrmyb65；

20、(2)含有(1)所述基因pbrmyb65的表达盒；

21、(3)含有(1)所述基因pbrmyb65的重组载体；

22、(4)含有(2)所述表达盒的重组载体；

23、(5)含有(1)所述基因pbrmyb65的重组微生物；

24、(6)含有(2)所述表达盒的重组微生物；

25、(7)含有(3)所述重组载体的重组微生物；

26、(8)含有(4)所述重组载体的重组微生物。

27、进一步，(1)中编码所述转录因子子pbrmyb65的基因pbrmyb65的核苷酸序列如seqid no.1所示。

28、进一步，myb家族转录因子pbrmyb65与所述pbraco2基因启动子互作能够调控梨果实柠檬酸异构化或柠檬酸积累。更进一步的，所述的myb家族转录因子pbrmyb65通过与pbraco2基因启动子中的myb结合位点(p1：(-800)-(-795)；p2：(-203)-(-198))相结合促进pbraco2基因的表达，提高线粒体aco(mitaco)酶活性，进而抑制果实中柠檬酸的积累。p1结合位点序列为(+/-)caaccg/cggttg；p2结合位点序列为(+/-)cggttg/caaccg。

29、第四方面，本发明请求保护一种抑制蔷薇科果树的果实中柠檬酸的积累的方法，过表达编码所述转录因子pbrmyb65的基因pbrmyb65或/和pbraco2基因抑制果实中柠檬酸的积累；编码所述转录因子pbrmyb65的基因pbrmyb65的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述的pbraco2基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。

30、上述的应用和上述的方法，其中所述的蔷薇科果树为梨。

31、本发明技术方案的研究过程：

32、基于梨基因组数据库鉴定出所有的pbracos基因(6个基因家族成员)；进一步，通过分析‘鸭梨’果实不同生长发育时期pbracos基因表达谱及其与柠檬酸含量的相关性，筛选出可能参与调控柠檬酸异构化的家族成员pbraco2。

33、构建重组质粒pbi221-pbraco2-gfp，与线粒体标记蛋白mstp-mcherry共同转化拟南芥原生质体，利用激光共聚焦显微镜观察gfp荧光，发现pbraco2位于线粒体中。

34、构建pcambia1300-pbraco2过表达载体，转入农杆菌gv3101，转化梨愈伤组织；经pcr鉴定后获得阳性组织后，将阳性转基因组织及其对照(采用pcambia1300空载转化愈伤组织)转移至以山梨醇和蔗糖(1:1，w:w)作为碳源的ms培养基上生长。

35、利用qpt-pcr检测技术和mitaco酶活性检测试剂盒测定发现，梨pbraco2阳性转基因组织中pbraco2基因表达量和线粒体酶活性显著升高。

36、利用超高效液相色谱法(uplc)检测发现，柠檬酸含量在梨pbraco2阳性转基因组织中显著降低。

37、克隆pbraco2基因启动子，提交给plantcare数据库(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)，预测其中的顺式调控元件，发掘其中有w-box、g-box和myb结合元件，说明其可能受到pbrwrkys、pbrbzips和pbrmybs转录因子的调控。结合相关转录因子在梨果实生长发育期间表达量的变化趋势(与pbraco2表达量的相关系系数设定为>0.8或<-0.8)，筛选得到可能调控pbraco2基因表达的转录因子pbrmyb3、pbrmyb65和pbrmyb81。因为pbrmyb65与pbraco2表达水平的相关性最高，我们选择其开展进一步的研究。

38、构建重组质粒psak277-pbrmyb65，并以包含不同数目myb结合位点或其突变体(caaccg/cggttg→cttccg/cggaag)的pbraco2基因启动子序列构建报告载体(pgreenii0800-pbraco2pro-luc(全长启动子)、pgreenii 0800-pbraco2profrag1-luc、pgreenii0800-pbraco2profrag2-luc、pgreenii 0800-pbraco2promut-luc)，分别转入农杆菌gv3101与gv3101(psoup)。以携带psak277-pbrmyb65与报告载体的农杆菌菌株共同侵染烟草叶片，进行萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性检测，发现psak277-pbrmyb65&pgreenii 0800-pbraco2pro-luc(或psak277-pbrmyb65&pgreenii 0800-pbraco2profrag1-luc)共转化的烟草叶片luc/ren比值显著高于对照组，而psak277-pbrmyb65&pgreenii 0800-pbraco2profrag2-luc(或psak277-pbrmyb65&pgreenii 0800-pbraco2promut-luc)共转化的烟草叶片luc/ren比值与其对照组之间没有显著差异。

39、构建猎物载体pbrmyb65-ad，并以包含myb结合位点(p1：(-800)-(-795)；p2：(-203)-(-198))或其突变体(caaccg/cggttg→cttccg/cggaag)的pbraco2启动子片段构建诱饵载体(pbraco2pros1-pabai、pbraco2pros2-pabai、pbraco2pros1mut-pabai和pbraco2pros2mut-pabai)；利用matchmaker gold yeast one-hybrid library screeningsystem酵母单杂交文库筛选系统检测到pbrmyb65可以与包含myb结合位点的启动子片段(pbraco2pros1-pabai和pbraco2pros2-pabai)结合，但突变位点后(pbraco2pros1mut-pabai和pbraco2pros2mut-pabai)，pbrmyb65不能与其结合。

40、以携带pcambia1300-gfp的梨愈伤组织为对照。对包含myb结合位点(p1：(-800)-(-795)；p2：(-203)-(-198))的pbraco2启动子片段进行染色质免疫共沉淀定量pcr(chip-qpcr)分析，发现pbrmyb65可与包含myb结合位点的启动子片段结合。

41、结合进一步的电泳迁移率(emsa)试验结果，得出pbrmyb65通过与pbraco2基因上游启动子中的myb结合位点(p1：(-800)-(-795)；p2：(-203)-(-198))结合进而激活其表达。

42、构建重组质粒pbi221-pbrmyb65-gfp，与细胞核标记蛋白ath2b-mcherry共同转化拟南芥原生质体，利用激光共聚焦显微镜观察gfp荧光，发现pbrmyb65位于细胞核中。

43、构建pcambia1300-pbrbmyb65过表达载体，转入农杆菌gv3101，侵染梨愈伤组织；经pcr鉴定后获得阳性组织后，将阳性转基因组织及其对照(采用pcambia1300空载转化愈伤组织)转移至以山梨醇和蔗糖(1:1)作为碳源的ms培养基上生长。

44、利用qpt-pcr检测技术和线粒体aco(mitaco)酶活性检测试剂盒测定发现，梨pbrbmyb65阳性转基因愈伤组织中pbrmyb65和pbraco2基因表达量以及mitaco酶活性显著升高；

45、利用超高效液相色谱法(uplc)检测发现，柠檬酸含量在梨pbrbmyb65阳性转基因愈伤组织中显著降低。

46、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

47、1、首次揭示了调控梨果实pbraco2基因表达的转录因子pbrmyb65。

48、2、本发明阐明了pbrmyb65与pbraco2基因启动子中的myb结合位点(p1：(-800)-(-795)；p2：(-203)-(-198))互作在调控梨果实柠檬酸异构化的作用机制，为实现梨果实品质性状的定向改良提供了理论及实践基础。