一种转基因马铃薯特异性实时荧光PCR检测引物、探针、方法和试剂盒与流程

本发明属于转基因产品检测领域，具体涉及一种转基因马铃薯特异性实时荧光pcr检测引物、探针、方法和试剂盒。

背景技术：

1、目前国外上市的转基因马铃薯约47种，转基因马铃薯批准种植或作为食用的国家和地区主要包括美国、加拿大、澳大利亚、日本、韩国、德国、瑞典、捷克、墨西哥等。

2、我国尚未批准转基因马铃薯上市。2017年01月深圳检出6批次进口薯片含转基因成分，退运4.8吨(https://www.guancha.cn/society/2017_01_25_391308.shtml)，但其未说明具体转基因马铃薯品系。随着食品的进口量不断增大，转基因马铃薯及产品入境风险增高，需要有特异、快速、准确、高通量的检测技术作为支撑。

3、目前国外上市的品系中，仅欧盟建立的eh92-527-1品系品系特异性检测方法：savini c.,foti n.,mazzara m.,charles delobel c.,van den eede g.；"event-specific method for thequantification of event eh92-527-1potato using real-time pcr-validation report and protocol-sampling and dna extraction ofpotato"online publication(2006)此外，高宏伟等建立的一种马铃薯品系av43-6-g7(未上市)检测方法：gao h,yu x,deng t,et al.event-specific detectionof transgenicpotato av43-6-g7 using real-time and digital pc r methods[j].bmcbiotechnology,2016,16(1):74.)。

4、innate转基因马铃薯由美国辛普劳公司应用rnai的技术研发，于2014-2018年陆续在美国，澳大利亚，加拿大，日本，马来西亚，墨西哥，新西兰上市，innate(innate 1代和innate 2代目前共约15个品系)转基因马铃薯主要沉默了asn1,ppo5,pphl,pr1基因，可以减少运输过程中导致的淤青和黑斑，同时减少油炸后产生的致癌物质丙烯酰胺，innate2除上述四个基因外，还沉默了vlnv和rpi-vnt1基因，增加了耐低温储存和抗土豆晚疫病的特性。由于涉及品系多，目前尚无通用的检测方法，本发明拟根据颗粒结合淀粉合酶基因的启动子(pgbss,promoter of the granule-bound starch synthase gene)区域建立检测方法实现innate转基因马铃薯品系的通用性检测。

5、目前对转基因产品多数国家均采用相应的标识管理制度，标识管理制度的建立和实施依赖于有效准确的检测鉴定技术。为完善我国转基因产品定量检测技术体系，保护消费者对转基因产品的知情权和选择权，为进出境口岸监管部门提供转基因马铃薯检测鉴定的方法，针对innate转基因马铃薯构建特异性实时pcr检测方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种特异性好、灵敏度高、稳定性强，快速准确鉴别innate转基因马铃薯特异性实时荧光pcr检测引物、探针、方法和试剂盒。

2、本发明的第一个目的是提供一种innate转基因马铃薯特异性实时荧光pcr检测引物探针组，包括检测引物和检测探针，所述的检测引物如下所示：

3、pgbss-f：5'-ccaaagctggactagattatctgg-3'(如seq id no.1所示)；

4、pgbss-r：5'-aatttatagcataacgatgagctcta-3'(如seq id no.2所示)；

5、所述的检测探针如下所示：

6、pgbss-p：5'-atgaacttaggttcagcttgttgtgtcaagta-3'(如seq id no.3所示)，探针的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。

7、所述的荧光报告基团为vic，所述的荧光淬灭基团为bhq1。

8、本发明的第二个目的是提供一种innate转基因马铃薯特异性实时荧光pcr检测试剂盒，包括实时荧光定量pcr反应液、耐热dna聚合酶、检测引物和检测探针，所述的检测引物如下所示：

9、pgbss-f：5'-ccaaagctggactagattatctgg-3'(如seq id no.1所示)；

10、pgbss-r：5'-aatttatagcataacgatgagctcta-3'(如seq id no.2所示)；

11、所述的检测探针如下所示：

12、pgbss-p：5'-atgaacttaggttcagcttgttgtgtcaagta-3'(如seq id no.3所示)，探针的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。

13、所述的荧光报告基团为vic，所述的荧光淬灭基团为bhq1。

14、本发明的第三个目的是提供一种innate转基因马铃薯特异性实时荧光pcr检测方法，该检测方法包括以下步骤：

15、(1)提取样品的基因组dna作为模板；

16、(2)加入上述的检测引物探针组，与实时荧光定量pcr反应液及耐热dna聚合酶混合形成扩增反应体系；

17、(3)将扩增反应体系在荧光pcp仪上进行实时荧光pcr反应，反应结束后，根据扩增曲线判断样品是否为innate转基因马铃薯。

18、所述的步骤(2)的扩增反应体系为：25μl，包括premix ex taq 12.5μl，roxreferencedye ii 0.2μl，10μmol/l检测引物pgbss-f和pgbss-r各0.5μl，10μmol/l检测探针pgbss-p 0.5μl，dna模板2μl和ddh2o 8.8μl。

19、所述的步骤(3)的实时荧光pcr反应，其反应程序为95℃30s；95℃5s、60℃34s，40个循环，于60℃收集荧光信号。

20、所述的步骤(3)的根据扩增曲线判断样品是否为innate转基因马铃薯的标准为：如果扩增曲线有典型荧光扩增曲线，则说明样品为innate转基因马铃薯；如果扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则说明样品不是innate转基因马铃薯。

21、本发明的第四个目的是提供一种innate转基因马铃薯特异性实时荧光pcr定量检测方法，该定量检测方法包括以下步骤：

22、(1)提取innate转基因马铃薯的基因组dna进行梯度稀释以用作不同起始浓度的模板，加入上述的检测引物探针组，与实时荧光定量pcr反应液及耐热dna聚合酶混合形成扩增反应体系，在荧光pcr仪上进行实时荧光pcr反应；

23、(2)反应后得到各起始浓度模板对应的ct值，该ct值与起始模板量的常用对数(lg)呈线性关系，据此得到该线性范围内innate转基因马铃薯的标准曲线；

24、(3)提取待测样品的基因组dna为模板，加入与步骤(1)中相同体系的检测引物探针组，与实时荧光定量pcr反应液及耐热dna聚合酶混合形成扩增反应体系，在荧光pcr仪上进行实时荧光pcr反应，反应后得到ct值，将其代入步骤(2)获得的innate转基因马铃薯的标准曲线方程，计算得到待检样品中innate转基因马铃薯基因组dna的含量(拷贝数或质量)。

25、所述的步骤(1)的扩增反应体系为：25μl，包括premix ex taq 12.5μl，roxreferencedye ii 0.2μl，10μmol/l检测引物pgbss-f和pgbss-r各0.5μl，10μmol/l检测探针pgbss-p 0.5μl，dna模板2μl和ddh2o 8.8μl；所述的步骤(1)的实时荧光pcr反应，其反应程序为95℃30s；95℃5s、60℃34s，40个循环，于60℃收集荧光信号。

26、本发明针对innate转基因马铃薯共有的特异性序列设计引物和taqman探针，建立innate转基因马铃薯实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)检测方法，利用该检测引物和检测探针，按照本发明的方法进行检测发现其定量检测下限为20copies/μl，重复性实验显示本方法的标准偏差(sd)及相对标准偏差(rsd)都在可接受范围内，特异性良好、灵敏度高、稳定性强，可满足监管部门和公众对innate转基因马铃薯进行品系特异性检测鉴定的需求。