一种三维肺上皮细胞聚集体及其作为肺炎症模型的应用

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种三维肺上皮细胞聚集体及其作为肺炎症模型的应用。

背景技术：

1、肺是人体内重要的呼吸器官，肺泡是其中的核心功能单位。因肺脏独特的生理结构特点，以肺脏为主要靶器官的呼吸系统疾病严重影响着人们的身体健康，建立适合的模拟肺部疾病的研究模型和药物筛选模型尤为重要。常规二维（two-dimension，2d）细胞模型由于缺乏组织结构以及微环境的影响，无法真实反应体内生物学过程；由于各类动物模型的应用，对肺脏生理学的理解有了很大的进步，但因为人类和动物在生理机制上的差异，以及动物模型的研发成本和周期等限制，不能有效的进行高通量药物筛选研究。因此，基于人类细胞体外培养新模型的研究显得尤为重要。二维液体细胞培养是一种相对稳定、成本相对较低的培养方法，有利于高通量筛选和各种定量、定性分析。但是液体培养细胞不能反映呼吸系统的天然空气界面，影响细胞的分化和生长过程。在体内，细胞通常被细胞外基质包围或者与来自相同或不同谱系的细胞直接物理接触。与二维模型相比，三维（three-dimension，3d）模型能够更准确的反应体内的生理结构，可以提供生物系统中结构、机械和空间条件，这些因素可以指导分化和发育过程。三维培养模型可以在一定程度上弥补二维培养不足之处，能够模拟体内组织结构，再现复杂的细胞间通讯，所以近年来体外三维细胞模型也成为一个研究的热点。

2、3d细胞培养技术是细胞在一定的环境中形成一个三维立体结构，一般三维培养可以分为两类：支架三维培养和无支架三维培养。支架三维培养是将细胞接种在疏松多孔的细胞支撑结构中，进而形成三维结构。支架材料一般有水凝胶支架、天然支架、固体多孔支架。理想的支架材料应具备以下特点：无细胞毒性、具有良好的生物组织相容性、具有一定的孔隙、具有生物可降解性、可塑性、能促进细胞间黏附和增殖等。基质胶（matrigel）是天然支架中的一种，来源于engelbreth-holm-swarm（ehs）小鼠肿瘤基底膜，主要由层粘连蛋白、ⅳ型胶原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、巢蛋白等组成，可以提供类似体内细胞外环境的结构，通过matrigel刚度的可调性影响干细胞的分化，广泛应用于干细胞培养及类器官培养。无支架培养通常是以细胞本身的附着聚集力为基础，使细胞聚集成三维结构，一般包括旋转生物反应器和超低吸附细胞培养等方法。然而，使用无支架聚集培养物的方法仅限于创建组织样结构，在培养过程中缺乏器官样ecm而不能形成器官样结构。

3、甲基纤维素（methyl cellulose，mc）是一种长链取代纤维素，常温下为白色粉末，无毒、无刺激性，在水中溶胀成半透明粘性胶体溶液，其水溶液在常温下很稳定。mc因其水溶性、良好的加工性以及生物相容性等优良性能，已广泛应用于食品工业和生物医学等许多领域。mc在细胞培养中常用于造血克隆的培养，其刚性特性有助于干细胞分化。

4、肺脏因其独特的生理功能，与外界空气直接接触，空气中的可吸入物质对呼吸系统的健康有着重要影响。空气中的一些污染物质、致病微生物和病毒吸入肺脏中会造成肺部疾病，造成感染引起炎症反应，毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致急性低氧性呼吸功能不全或呼吸衰竭，这种临床综合症称为急性肺损伤，严重的急性肺损伤称为急性呼吸窘迫综合征。炎症是机体免疫应答的重要机制之一，目前建立肺炎症模型常用脂多糖（lipopolysaccharide，lps）为造模剂，lps是革兰氏阴性细菌细胞壁的组成成分，主要由脂质和多糖构成，可作用于多种免疫细胞、内皮细胞、上皮细胞等组织细胞，合成和释放多种细胞因子和炎性介质，最终造成组织损伤和器官功能损伤。lps与靶细胞结合后，激活tlr4信号通路，继而激活irf-3和nf-κb信号通路，最终引起炎症因子的释放，形成炎症反应。

技术实现思路

1、本发明的目的为构建稳定、经济、简便的无支架三维肺上皮模型。

2、本发明首先保护一种三维肺上皮细胞聚集体的制备方法，可包括如下步骤：用含甲基纤维素的培养基培养肺上皮细胞。

3、上述制备方法中，所述培养基中甲基纤维素的浓度可为0.25%-0.50%（如0.25%-0.35%、0.35%-0.45%、0.45%-0.50%、0.25%、0.35%、0.45%或0.50%）。

4、上述制备方法中，所述培养基中甲基纤维素的浓度优选为0.25%。

5、上述制备方法中，所述培养基可为dmem高糖培养基或rpmi1640培养基。

6、上述制备方法中，所述培养基还可含有血清和/或抗生素。

7、所述培养基中，血清的浓度可为8-12%（如8-10%、10-12%、8%、10%或12%）。血清可为胎牛血清（fbs）。

8、上述制备方法中，所述抗生素可为青霉素和/或链霉素。

9、所述培养基中，青霉素的浓度可为0.8-1.2%（如0.8-1.0%、1.0-1.2%、0.8%、1.0%或1.2%）。

10、所述培养基中，链霉素的浓度可为0.8-1.2%（如0.8-1.0%、1.0-1.2%、0.8%、1.0%或1.2%）。

11、上述制备方法中，所述培养基具体可为含0.5%甲基纤维素、10%、1%青霉素和1%链霉素的dmem高糖培养基或含0.25%甲基纤维素、10%fbs、1%青霉素和1%链霉素的dmem高糖培养基。

12、上述制备方法中，所述肺上皮细胞可为人肺腺癌细胞系a549。

13、上述制备方法中，培养肺上皮细胞的培养体系中，肺上皮细胞和所述含甲基纤维素的培养基的比例可为（1×104-5.0×104）个：200μl（如（1×104-2.5×104）个：200μl、（2.5×104-5.0×104）个：200μl、1×104个：200μl、2.5×104个：200μl或5.0×104个：200μl）。

14、上述制备方法中，培养肺上皮细胞的培养体系中，肺上皮细胞和所述含甲基纤维素的培养基的比例优选为5.0×104个：200μl。

15、上述制备方法中，所述培养的天数可为3-7天（如3天、4天、5天、6天或7天）。

16、上述制备方法中，所述培养的条件具体可为37℃、5% co2。

17、上述任一所述制备方法制备的三维肺上皮细胞聚集体也属于本发明的保护范围。

18、本发明还保护采用上述任一所述制备方法制备的三维肺上皮细胞聚集体的应用，可为a1）或a2）或a3）：

19、a1）作为肺炎症模型；

20、a2）筛选用于预防或治疗肺部炎症的药物；

21、a3）作为无支架三维肺上皮模型。

22、上述应用中，所述肺炎症模型可为细菌脂多糖lps诱导的肺炎症模型。

23、本发明的发明人经过大量实验，成功建立了a549多细胞球体（即三维肺上皮细胞聚集体或三维肺上皮多细胞球体），其为以a549细胞为基础（5×104/孔细胞浓度）、甲基纤维素作为培养基添加剂（0.25%甲基纤维素浓度）构建的无支架三维模型。对构建的a549多细胞球体进行转录组测序，以探究整体基因表达谱的变化。结果表明，a549多细胞球体中与炎症相关通路均上升，与细胞分裂、染色体复制相关通路均下降。此外，还发现a549多细胞球体在lps刺激后炎性因子基因表达显著增强，即a549多细胞球体对lps刺激的免疫应答更为明显。由此可见，本技术建立的a549多细胞球体可以作为脂多糖诱导的肺炎症模型，进一步研究肺部炎症反应的致病机理以及药物筛选。本发明具有重要的应用价值。