用于检测赭曲霉毒素A的荧光探针及其制备方法与应用

本发明涉及有害物检测，尤其涉及用于检测赭曲霉毒素a的荧光探针及其制备方法与应用。

背景技术：

1、赭曲霉毒素a(ochratoxin a,ota)是真菌属(曲霉等)产生的初级真菌毒素和次生真菌代谢物。它经常在食品(包括谷物及其衍生物、啤酒、葡萄酒、香料和咖啡)的生产、加工、储存和运输过程中由于处理不当产生。这种污染延伸到整个食品供应链，造成了巨大的经济损失。已有研究表明，ota可以渗透到人类和动物的食物链中，对两者的健康产生严重的有害影响，如致癌性、肾毒性、肝毒性、遗传毒性和神经毒性。因此，ota已被国际癌症研究机构(iarc)列为2b类致癌物。欧盟委员会制定了严格的指导方针，规定食品中ota的最大允许残留量为0.5至30ppb。同样，中国食品安全国家标准gb2761-2017规定，食品中ota的最大允许残留量(mrl)应在2-10ppb范围内。因此，开发食品中ota的可靠分析方法具有至关重要的意义。

2、目前已经有多种检测ota的方法。传统方法包括高效液相色谱法(hplc)、高效液相色谱-荧光检测法(hplc-fld)、液相色谱-质谱法(lc-ms/ms)和高效液相色谱-质谱法(hplc-ms/ms)。虽然这些方法具有良好的灵敏度和准确性，但它们通常需要昂贵的仪器，专业的操作人员和复杂的样品制备过程，因而不足以轻松快速地检测实际样品中的分析物。

3、相比于传统方法，荧光法具有响应快、灵敏度高、选择性高、可直接原位检测目标物的特点和优势。到目前为止，已经报道了许多用于ota检测的荧光探针。其中大多数是适配体探针，利用ota特异性适配体作为识别片段。然而，这些感应探针的反应时间往往较长(＞10分钟)，这是由于修饰引起的与ota的亲和力降低和适体重构过程缓慢。其他荧光方法都有各自的缺点，如灵敏度差、便携性差、适用范围窄等。因此，开发一种能够快速、方便地检测实际食品样品中ota的方法是迫切需要的。

技术实现思路

1、鉴于上述现有技术的不足，本发明提供了用于检测赭曲霉毒素a的荧光探针及其制备方法与应用，旨在解决现有检测方法检测赭曲霉毒素a时的高成本、检测速度慢、复杂操作和适用范围窄的技术问题。

2、具体地，本发明的技术方案如下：

3、本发明提供一种用于检测赭曲霉毒素a的荧光探针，所述荧光探针为荧光染料doce与血清白蛋白(albumin,alb)通过氢键结合的复合物；

4、所述荧光染料doce的化学结构式如下所示：

5、

6、本发明还提供一种所述的荧光探针的制备方法，包括步骤：

7、将2-羟基苯乙酮和4-(二甲氨基)肉桂醛反应，得到中间产物hsf；

8、将所述中间产物hsf和2-乙基丁酰氯进行酯化反应，得到所述荧光染料doce；

9、将所述荧光染料doce与血清白蛋白混合，得到所述荧光探针。

10、所述的荧光探针的制备方法，其中，所述将2-羟基苯乙酮和4-(二甲氨基)肉桂醛反应，得到中间产物hsf的步骤，包括：

11、将2-羟基苯乙酮和4-(二甲氨基)肉桂醛溶于乙醇中，得到反应溶液，在所述反应溶液中加入氢氧化钾溶液，室温搅拌后置于冰浴中，加入双氧水溶液后，再放置于室温下进行搅拌，加入冰水和盐酸，得到沉淀物，将所述沉淀物过滤、洗涤，得到所述中间产物hsf。

12、所述的荧光探针的制备方法，其中，将所述中间产物hsf和2-乙基丁酰氯溶于n,n-二甲基甲酰胺中，得到混合溶液进行酯化反应，得到所述荧光染料doce的步骤，包括：

13、将所述中间产物hsf和2-乙基丁酰氯溶解于n,n-二甲基甲酰胺中，得到混合溶液，在所述混合溶液中加入碳酸铯，室温搅拌，进行酯化反应后经二氯甲烷提取、干燥、减压蒸馏和纯化，得到所述荧光染料doce。

14、所述的荧光探针的制备方法，其中，所述荧光染料doce与所述血清白蛋白的摩尔比为1:1。

15、本发明提供了一种定量检测面粉中赭曲霉毒素a(ota)的方法，包括：

16、将面粉浸泡在pbs缓冲液和甲醇的混合溶液中，得到面粉混合物，将所述面粉混合物涡旋、超声处理，得到悬浮液，离心后取上清液作为测试液；

17、在所述测试液中加入所述荧光探针，再滴加不同浓度梯度的赭曲霉毒素a溶液，测量荧光光谱，建立发射峰的荧光强度比率与赭曲霉毒素a浓度的标准曲线，确定赭曲霉毒素a的检测限；

18、利用所述标准曲线定量检测未知的面粉样品中赭曲霉毒素a的含量。

19、所述的定量检测面粉中赭曲霉毒素a的方法，其中，所述pbs缓冲液和所述甲醇的混合比例为4:1。

20、所述的定量检测面粉中赭曲霉毒素a的方法，其中，所述发射峰的荧光强度比率为荧光光谱中450nm和575nm的发射峰的比值。

21、本发明还提供了一种定性检测葡萄酒中赭曲霉毒素a的方法，包括：

22、将葡萄酒过滤，得到除去不溶物和色素的滤液，在所述滤液中加入所述荧光探针后作为空白组，进行紫外光照射，拍摄所述空白组的荧光颜色；

23、在所述滤液中加入赭曲霉毒素a溶液，再加入所述荧光探针后作为测试组，进行紫外光照射，拍摄所述测试组的荧光颜色；

24、对比所述空白组与所述测试组的荧光颜色，建立赭曲霉毒素a的定性分析标准；

25、利用所述定性分析标准对未知的葡萄酒样品中的赭曲霉毒素a进行定性检测。

26、所述的定性检测葡萄酒中赭曲霉毒素a的方法，其中，所述紫外光照射采用365nm激发波长。

27、有益效果：

28、本发明提供了用于检测赭曲霉毒素a的荧光探针及其制备方法与应用，将所述荧光探针为荧光染料doce与血清白蛋白alb通过氢键结合的复合物，可用于快速定量或定性检测赭曲霉素a(ota)，本发明中ota的检测方法具有超快的响应速度(5秒)，高灵敏度(检测限为0.39ppb)，以及高选择性。所述荧光探针在检测ota时，其荧光信号会实现从黄色到蓝色的颜色变化，该响应信号可以由智能手机直接识别，并已成功应用于面粉、白葡萄酒和红葡萄酒等真实食品样品的现场快检。

技术特征：

1.一种用于检测赭曲霉毒素a的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针为荧光染料doce与血清白蛋白通过氢键结合的复合物；

2.一种如权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括步骤：

3.根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述将2-羟基苯乙酮和4-(二甲氨基)肉桂醛反应，得到中间产物hsf的步骤，包括：

4.根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，将所述中间产物hsf和2-乙基丁酰氯溶于n,n-二甲基甲酰胺中，得到混合溶液进行酯化反应，得到所述荧光染料doce的步骤，包括：

5.根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述荧光染料doce与所述血清白蛋白的摩尔比为1:1。

6.一种定量检测面粉中赭曲霉毒素a的方法，其特征在于，包括：

7.根据权利要求6所述的定量检测面粉中赭曲霉毒素a的方法，其特征在于，所述pbs缓冲液和所述甲醇的混合比例为4:1。

8.根据权利要求6所述的定量检测面粉中赭曲霉毒素a的方法，其特征在于，所述发射峰的荧光强度比率为荧光光谱中450nm和575nm的发射峰的比值。

9.一种定性检测葡萄酒中赭曲霉毒素a的方法，其特征在于，包括：

10.根据权利要求9中所述的定性检测葡萄酒中赭曲霉毒素a的方法，其特征在于，所述紫外光照射采用365nm激发波长。

技术总结
本发明涉及有害物检测技术领域，具体为用于检测赭曲霉毒素A的荧光探针及其制备方法与应用。所述用于检测赭曲霉毒素A的荧光探针为荧光染料DOCE与血清白蛋白通过氢键结合的复合物；其中，荧光染料DOCE的化学结构式如所示。本发明制备的所述荧光探针用于快速定量或定性检测赭曲霉素A(OTA)，该检测方法具有超快的响应速度(5秒)，高灵敏度(检测限为0.39ppb)，以及高选择性，已成功应用于面粉、白葡萄酒和红葡萄酒等真实食品样品的现场快检。

技术研发人员：刘斌,张铭元
受保护的技术使用者：深圳大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/19