抗人αvβ8单克隆抗体的制作方法

本发明涉及抗体药物，尤其涉及抗人αvβ8单克隆抗体。

背景技术：

1、alpha v beta 8：全称integrin alpha-v beta-8(itgav:itgb8).是整合素家族成员之一，分子量为194kd，由itgav和itgb8两个亚单位组成的异源二聚体，在胞内通过二硫键组装，表达在细胞膜上，是细胞表面重要的黏附分子和信号传导功能受体，其主要功能是激活tgfβ信号通路，在肿瘤免疫中起到负调控的作用。stephenl.nishimura团队发文证明αvβ8肿瘤细胞中高表达，在tme中，肿瘤上的αvβ8与免疫细胞上的l-tgfb互作，促使cd4+t细胞向itreg细胞分化，通过treg的调控从而实现免疫逃逸。目前针对αvβ8在研的抗体药物主要为阻断活性抗体，现有文献证明αvβ8在多种肿瘤细胞中有表达，例如：αvβ8在人肺腺癌细胞colo699，人卵巢癌细胞ovcar3中高表达。

2、tgfβ信号通路：tgfβ广泛存在于各种生物体内，在正常情况下以复合体的形式存在，处于未激活的状态，tgfβ信号激活可调节细胞的生长，增殖，细胞分化与衰老，细胞死亡，细胞黏连与迁移，以及胞外基质合成与重塑等多种生命活动。tgfβ信号转导发生异常可能导致多种疾病的发生，如肿瘤发生，心血管疾病，免疫性疾病等，tgfβ在肿瘤中作用是双面的，在肿瘤发生早期tgfβ起到抑制肿瘤增长的作用，然而到了肿瘤后期，tgfβ又起到促进肿瘤增长的作用。在肿瘤发生后期，αvβ8在多种肿瘤细胞中高表达，可以和tgfβ前体复合物结合，激活tgfβ信号转导，促进肿瘤增长。

3、目前，对αvβ8抗体的构建主要包括如下步骤：首先获得基因敲出itgav/itgb8的bal/bc小鼠，然后通过人αvβ8胞外段二聚体蛋白及过表达细胞株免疫，利用噬菌体展示技术获得鼠源抗体，通过噬菌体上清活性分析(elisa结合，细胞阻断试验)获得候选鼠抗，将鼠抗轻重链基因可变区序列(即cdr区)克隆至编码人抗体轻重链恒定区序列的上游，进行哺乳动物细胞表达，制备嵌合抗体。对嵌合抗体进行生化试验和细胞结合试验来分析抗体的亲和力、特异性和鼠，猴的交叉活性，并对候选抗体进行了功能检测(阻断试验)。然而，目前已报道的αvβ8与l-tgfβ结合表位，人鼠猴兔高度同源，如果用传统的免疫方式很难拿到特异性结合该表位的抗体。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供抗人αvβ8单克隆抗体，以期能够阻断αvβ8与l-tgfβ的结合。

2、本发明提供的抗人αvβ8单克隆抗体，

3、其重链cdr1的氨基酸序列为sywx1x2或者与其具有至少80％(优选85％、90％、95％、98％或者99％)序列同一性的序列；其中，x1为i、m或v；x2为h或q。

4、其重链cdr2的氨基酸序列为x3idpsdx4yx5x6x7x8qkfkg或者与其具有至少80％(优选85％、90％、95％、98％或者99％)序列同一性的序列；其中，x3为q、l或e；x4为s或n；x5为t或i；x6为d或n；x7为f或y；x8为t或n。

5、其重链cdr3的氨基酸序列为syfgnwgfay、lpggldgvywyfdv或者pyfassfywyfdv或者与上述序列具有至少80％(优选85％、90％、95％、98％或者99％)序列同一性的序列；

6、其轻链cdr1的氨基酸序列为kasqx9vx10tx11va或者与其具有至少80％(优选85％、90％、95％、98％或者99％)序列同一性的序列；其中，x9为d或n；x10为s或g；x11为a或n；

7、其轻链cdr2的氨基酸序列为sasyryx12或者与其具有至少80％(优选85％、90％、95％、98％或者99％)序列同一性的序列；其中，x12为t或s；

8、其轻链cdr3的氨基酸序列为qqx13x14sx15px16t或者与其具有至少80％(优选85％、90％、95％、98％或者99％)序列同一性的序列；其中，x13为h或y；x14为y或n；x15为t或y；x16为w或l。

9、一些实施例中，本发明所述的抗人αvβ8单克隆抗体，

10、其重链cdr1为：sywih、sywmh或sywvq；

11、其重链cdr2为：qidpsdsytdftqkfkg、lidpsdnyinynqkfkg或eidpsdny tnynqkfkg；

12、其重链cdr3为：syfgnwgfay、lpggldgvywyfdv或pyfassfywyfdv；

13、其轻链cdr1为：kasqdvstava或kasqnvgtnva；

14、其轻链cdr2为：sasyryt或sasyrys；

15、其轻链cdr3为：qqhystpwt或qqynsyplt。

16、一些实施例中，本发明所述的抗人αvβ8单克隆抗体，

17、其重链三个cdr区分别为：sywih、qidpsdsytdftqkfkg和syfgnwgfay；

18、或者重链三个cdr区分别为：sywmh、lidpsdnyinynqkfkg和lpggldgvy wyfdv；

19、或者重链三个cdr区分别为：sywvq、eidpsdnytnynqkfkg和pyfassfy wyfdv。

20、一些实施例中，本发明所述的抗人αvβ8单克隆抗体，

21、其轻链三个cdr区分别为：kasqdvstava、sasyryt和qqhystpwt；

22、或者其轻链三个cdr区分别为：kasqnvgtnva、sasyrys和qqynsyplt。

23、一些具体实施例中，本发明所述的抗人αvβ8单克隆抗体，

24、其重链可变区具有如seq id no:9～11任一项所示的氨基酸序列；

25、其轻链可变区具有如seq id no:12～14任一项所示的氨基酸序列。

26、本发明所述的抗人αvβ8单克隆抗体为嵌合抗体，其重链恒定区为人igg、人iga、人igd、人igm或人ige，其轻链的恒定区为κ型或λ型。一些实施例中，本发明所述抗体的重链的恒定区为人igg1，轻链的恒定区为κ型。

27、本发明提供的抗人αvβ8单克隆抗体具有高亲和力、高特异性的特点，并且能够有效阻断受体αvβ8与配体l-tgfβ的结合，抑制tgfβ信号转导，从而起到治疗相关疾病的作用。

28、本发明还提供了编码所述抗人αvβ8单克隆抗体的核酸。

29、本发明的核酸是编码抗人αvβ8单克隆抗体轻链可变区的核酸，或者为编码重链可变区的核酸。所述的核酸可以是dna、rna、cdna或pna。其可为单链的或是双链的。所述核酸可以包括具有不同功能的核苷酸序列，如编码区和非编码区如调控序列(例如启动子或转录终止子)。核酸在拓扑学上可以是线性或环状的。核酸可以是例如载体(如表达或克隆载体)的一部分，或一个片段或多个片段的组合。所述核酸可直接从天然来源获得，或者可由重组、酶法或化学技术辅助制备。所述rna形式为由基因转录获得的mrna等。

30、进一步的，本发明还提供了一种质粒载体，包括如前所述的核酸。

31、本发明中，所述的质粒载体的骨架来源于植物、动物、细菌、真菌、噬菌体或病毒，本发明对此不做限定，一些实施例中，所述质粒载体的骨架载体选自pcdna3.1、abvec2.0-higg1、pcomb3xtt、pcomb3、pfuse-higg4-fc2、pcomb3xlambda、pee12.4、pee6.4、pcho1.0、pcomb3xss、pfuse-higg1e1-fc2、pcdna3.1-higg1-fc2、pfuse-higg1-fc2、pfuse-migg1-fc2、ptt5_higg1.g1m3或ptt5_hkappa.km3。

32、进一步的，本发明还提供了一种细胞，其包括如前所述的质粒载体，或者基因组中整合有如前所述的核酸。

33、本发明所述的宿主用于本发明所述核酸的保存或扩增，也可用于所述抗体的构建与表达，本发明对此不做限定。一些实施例中，所述细胞为原核细胞或真核细胞，本发明中，所述原核生物包括但不限于大肠杆菌，所述的真核细胞包括真菌细胞、植物细胞、哺乳动物细胞或昆虫细胞，其选自酵母、cho细胞、bhk细胞、sp2/0、hek-293、hek293t、hep g2、hela、cho-k1、cos-1、cos-7、nih3t3、a204、a549、d-407、cho、hcs-2、ht-29、u87、sf9和fd-chos中的至少一种。

34、更近一步的，本发明还提供了如前所述抗人αvβ8单克隆抗体的制备方法，包括：培养如前所述的细胞、诱导抗人αvβ8单克隆抗体的表达。本发明所述的制备方法，还包括对诱导产物进行分离和纯化的步骤。

35、更进一步的，本发明还提供了如下i)～iv)任一种在制备治疗tgfβ信号通路相关疾病的药物中的应用；

36、i)、如前所述抗人αvβ8单克隆抗体；

37、ii)、如前所述的核酸；

38、iii)、如前所述的质粒载体；

39、iv)、如前所述的细胞。

40、本发明中，所述治疗包括阻断αvβ8与l-tgfβ结合。本发明中，所述治疗包括减缓或抑制疾病的发展。本发明中，所述tgfβ信号通路相关疾病包括肿瘤。所述肿瘤tgfβ信号通路高表达的肿瘤，一些实施例中，所述肿瘤选自膀胱癌、血癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、中枢神经系统癌症、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、胆囊癌、胃肠道癌、外生殖器癌、泌尿生殖道癌、头癌、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌、肌肉组织癌症、颈癌、口腔或鼻黏膜癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、脾癌、小肠癌、大肠癌、胃癌、睾丸癌和/或甲状腺癌。一些具体实施例中，所述肿瘤为肺腺癌。

41、更进一步的，本发明还提供了一种药物，其包括如下i)～iv)任一种；

42、i)、如前所述抗人αvβ8单克隆抗体；

43、ii)、如前所述的核酸；

44、iii)、如前所述的质粒载体；

45、iv)、如前所述的细胞。

46、更进一步的，本发明还提供了一种药物组合物，其包括如前所述的抗人αvβ8单克隆抗体和至少一种tgfβ信号通路相关疾病的治疗剂。

47、所述治疗剂以注射剂为主，不仅限于注射剂，可以与免疫检查点类抗肿瘤药物联用如pd1,pdl1,ctla4等；顺铂类，紫杉醇，皮质醇类等化药联用；亦可用放疗后治疗等。

48、本发明所述的药物中，还包括药学上可接受的辅料。

49、本发明所述的药物为口服制剂或注射剂。所述注射剂为注射用粉针剂或注射液剂。

50、更进一步的，本发明还提供了治疗tgfβ信号通路相关疾病的方法，其包括给予本发明所述的药物。本发明所述方法中，给予的方式包括注射或口服。

51、本发明通过噬菌体检测技术筛选获得了提供了抗人αvβ8单克隆抗体，该抗体具有良好的特异性和结合能力，并且该抗体能够阻断受体αvβ8与配体l-tgfβ的结合，从而抑制tgfβ信号的转导。以人肺腺癌细胞株为对象，本发明提供的抗体具有良好的结合效果，说明该抗体对tgfβ信号通路高表达的肿瘤具有潜在的治疗作用。