一种抑制乙酰胆碱酯酶、防治阿尔兹海默症的龙眼果肉提取物及其制备方法与应用

本发明属于生物医学。更具体地，涉及一种抑制乙酰胆碱酯酶、防治阿尔兹海默症的龙眼果肉提取物及其制备方法与应用。

背景技术：

1、阿尔兹海默症(ad)是一种多发性神经退行性疾病，是老年人群患痴呆症的最主要原因。乙酰胆碱是一种神经递质，在神经元之间传递信息的过程中起着关键作用。根据who的数据，目前全世界约有5000万ad患者，预计2050年，病例数将超过1.5亿。随着我国老龄化进程的加剧，中国ad患者的数量不仅位居世界第一，其增速也是全球最快的。因此，研发出可以有效缓解ad病情的药物对于减轻因ad带来的社会负担至关重要。全球各国制药企业一直以来都在争夺ad药物巨大的市场，辉瑞、默克、强生等制药巨头已尝试研发多种药物治疗ad，但均在临床阶段宣告失败。

2、有报道表明，阿尔茨海默症患者往往存在乙酰胆碱水平较低的情况，这是因为阿尔茨海默病损害了产生和使用乙酰胆碱的细胞，导致神经元信息传递功能障碍，学习和记忆功能减弱。胆碱能假说认为，与ad相关的认知障碍的病理生理学归因于胆碱能神经元的破坏或丢失，引起乙酰胆碱水平降低，从而导致认知功能障碍等一系列病理特征。抑制ache会导致ach的累积，进而增加毒蕈碱等的刺激，最终缓解ad导致的的记忆缺陷。因此，乙酰胆碱含量不足被认为是阿尔茨海默病老年痴呆症发生的一个主要因素。一些药物可以通过阻断酶的作用来增加乙酰胆碱的水平，这些药物被称为乙酰胆碱酯酶抑制剂或胆碱酯酶抑制剂(ache)。它们可以帮助缓解与思维过程相关的症状，如语言、判断和记忆。

3、中国专利申请cn103533948a公开了一种包含龙眼肉、丹参及天麻提取物作为有效成分的神经疾病的预防或治疗用组合物，所述神经疾病预防组合物对乙酰胆碱酯酶的活性起到抑制作用。然而龙眼肉、丹参及天麻提取物含有多种活性成分，无法确认是何种成分对乙酰胆碱酯酶的活性具有抑制作用。另外冉玉兵等学者(冉玉兵,刘磊,张瑞芬等.龙眼果肉提取物改善samp8小鼠学习记忆功能[j].现代食品科技,2017,33(06):1-8.doi:10.13982/j.mfst.1673-9078.2017.6.001.)公开了龙眼果肉醇提物的石油醚相和水相均能有效地改善老年痴呆模型小鼠samp8的学习记忆功能，但龙眼果肉醇提物的石油醚相和水相的化学成分尚不明确。上述专利和期刊文章公开的均为以中药提取物作为一个整体去研究其药效，无法确认其含有哪些具体活性成分以及其中含有的单体化合物的具体药效如何。中药提取物为中药经过提取浓缩后药材中多种成分的混合物，其中一些可能具有药效，另一些没有任何的药效甚至可能对人体产生不良影响，因此，非常有必要对中药提取物成分进行深入的研究，更好地了解中药的作用机制，提高中药的疗效和安全性，有利于推动中药现代化和国际化发展。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服现有技术中往往将龙眼肉提取物作为一个整体去研究，缺乏对其中具体有效单体化合物的富集或提纯制备以及其药效作用深入研究的缺陷和不足，提供一种抑制乙酰胆碱酯酶、防治阿尔兹海默症的龙眼果肉提取物。

2、本发明另一目的是提供所述龙眼果肉提取物在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂或阿尔兹海默症防治药物中的应用。

3、本发明另一目的是提供一种乙酰胆碱酯酶抑制剂或阿尔兹海默症防治药物，以所述龙眼果肉提取物为活性成分。

4、本发明上述目的通过以下技术方案实现：

5、本发明保护一种抑制乙酰胆碱酯酶、防治阿尔兹海默症的龙眼果肉提取物，该提取物主要含有化合物1和/或化合物2：

6、

7、上述龙眼果肉提取物由如下方法一和/或方法二制备得到：

8、方法一：将龙眼肉经醇提、醇沉制成的干膏，进行硅胶柱层析：以体积比为(1-2)：1的乙酸乙酯-甲醇溶液(优选体积比为1：1的乙酸乙酯-甲醇溶液，和/或2：1的乙酸乙酯-甲醇溶液)为洗脱液进行洗脱，得流份a；将流份a进行硅胶柱层析，以乙酸乙酯为洗脱液进行洗脱，得流份a-1；再将流份a-1经中压制备色谱进行分离纯化，以体积比为20:80的水-甲醇溶液为洗脱液进行洗脱，洗脱液进行干燥，得到主含化合物1的龙眼果肉提取物；

9、方法二：将龙眼肉经醇提、醇沉制成的干膏，进行硅胶柱层析：以乙酸乙酯为洗脱液，得流份b；将流份b经半制备液相色谱进行分离纯化，以体积比为8:92的水-甲醇溶液为洗脱液，进行洗脱，洗脱液进行干燥，得到主含化合物2的龙眼果肉提取物；

10、合并方法一和方法二所得为主含化合物1和化合物2的龙眼果肉提取物。

11、优选地，方法一中，洗脱液乙酸乙酯-甲醇溶液为1：1的乙酸乙酯-甲醇溶液，和/或2：1的乙酸乙酯-甲醇溶液。

12、进一步地，上述方法一和方法二中，所述龙眼肉经醇提、醇沉制成的干膏的制备方法包括如下步骤：

13、s1、取龙眼肉加入醇类溶剂，加热回流，冷却，摇匀，过滤，取滤液减压浓缩得粗浸膏；

14、s2、将步骤s1所得粗浸膏加入60～95vol％乙醇醇沉，过滤，取滤液进行减压浓缩后干燥，获得冻干干膏。

15、进一步地，方法一中所述硅胶柱为玻璃柱，填充的硅胶的目数为80～100目。

16、进一步地，方法二中所述硅胶柱为玻璃柱，填充的硅胶的目数为200～300目。

17、进一步地，所述中压制备色谱使用的色谱柱为碳十八色谱柱。

18、更进一步地，所述中压制备色谱使用的色谱柱的规格为36mm*460mm，粒径为40～63um。

19、进一步地，所述半制备液相色谱使用的色谱柱为碳十八反相色谱柱，优选为安捷伦10prep-c18，规格为30mm*150mm。

20、更具体地，作为一种可实施方案，上述龙眼果肉提取物由包括以下步骤的方法提取得到：

21、s1、取龙眼肉加入醇类溶剂，加热回流，冷却，摇匀，过滤，取滤液减压浓缩得粗浸膏；

22、s2、将步骤s1所得粗浸膏加入60～95vol％乙醇醇沉，过滤，取滤液进行减压浓缩后干燥，获得冻干干膏；

23、s3、将步骤s2所得冻干干膏进行硅胶柱层析，以乙酸乙酯-甲醇溶液为洗脱液进行梯度洗脱，经tlc(thin-layer chromatography，薄层层析)及hplc(high performanceliquid chromatography，高效液相色谱)检测合并相同部分，收集乙酸乙酯-甲醇体积比为2:1和1:1的流份，合并后进行干燥，得流份a；收集乙酸乙酯-甲醇体积比为1:0的流份，进行干燥，得流份b；

24、s4、将步骤s3所得流份a进行硅胶柱层析，以体积比为1：0的乙酸乙酯-甲醇溶液为洗脱液，进行洗脱，干燥，得流份a-1；

25、s5、将步骤s4所得流份a-1经中压制备色谱进行分离纯化，以体积比为20:80的水-甲醇溶液为洗脱液，进行洗脱，收集流份，进行干燥；

26、s6、将步骤s3所得流份b经半制备液相色谱进行分离纯化，以体积比为8:92的水-甲醇溶液为洗脱液，进行洗脱，收集流份，进行干燥；

27、s7、s5所得产物、s6所得产物或合并s5和s6所得产物，即为具有抑制乙酰胆碱酯酶、防治阿尔兹海默症活性的龙眼肉提取物。

28、具体地，tlc的条件为：展开剂为乙酸乙酯和甲醇，点样量为3～5ul，显色剂为碘熏蒸和硫酸乙醇显色；tlc通过观察样品的斑点形状、颜色的均一性来评估化合物的纯度。

29、hplc检测的条件为：色谱柱：安捷伦10prep-c18 30mm*150mm，以甲醇-水为流动相，流速为4ml/min，检测波长为254nm；hplc通过光谱图评估化合物纯度。

30、具体地，上述步骤s5所得产物即为化合物1，步骤s6所得产物即为化合物2。

31、发明人经过大量的实验，首次从龙眼肉中提取得到上述两个对乙酰胆碱酯酶具有抑制活性的龙眼果肉生物碱类化合物，能阻止乙酰胆碱酯酶降解乙酰胆碱，增加直接参与认知功能障碍的乙酰胆碱的含量水平，这说明上述两个龙眼果肉生物碱类化合物能够用于制备乙酰胆碱酯酶抑制剂，能被开发为阿尔兹海默症防治药物。

32、经过结构式对比检索发现，上述化合物1和化合物2的结构均被现有技术(化合物1：陈栋杰.中药枸杞子酰胺及苯丙素类成分分析及产地鉴别研究[d].南京中医药大学,2021.；化合物2：jung h j,jung h a,kang s s,et al.inhibitory activity of araliacontinentalis roots on protein tyrosine phosphatase 1b and rat lens aldosereductase.[j].archives of pharmacal research,2012,35(10).)公开，但未披露其活性。

33、因此，本发明要求保护上述两个化合物及富含该化合物的提取物及其在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂和阿尔兹海默症防治药物中的应用。

34、根据本发明成果，以龙眼肉为原料提取能够抑制乙酰胆碱酯酶、防治阿尔兹海默症的提取物，需尽量富集化合物1或/和化合物2。上述龙眼果肉提取物即为富集化合物1或/和化合物2的提取物。

35、在上述龙眼果肉提取物的提取方法中，优选地，步骤s1中，所述醇类溶剂为乙醇、甲醇、异丙醇、正丁醇中的任意一种或多种。

36、更优选地，当醇类溶剂为乙醇时，优选乙醇的使用浓度为60～95vol％。

37、优选地，步骤s1中，所述龙眼肉与醇类溶剂的质量体积比为1：8～10(kg/l)。

38、优选地，步骤s1中，所述加热回流的温度为50～80℃。

39、优选地，步骤s1中，所述加热回流的时间为0.5～1h。

40、优选地，步骤s1中，所述粗浸膏的相对密度为0.9～1.2。

41、优选地，步骤s1和s2中，所述减压浓缩的温度为50～65℃。

42、优选地，步骤s2中，所述干燥为冷冻干燥。

43、优选地，步骤s2中，所述加入60～95vol％乙醇醇沉2～5次。

44、具体地，步骤s3中，所述进行硅胶柱层析的具体操作为：将所得冻干干膏按照质量比为1：2～4与硅胶(80～100目)充分混合研磨，干法装柱，干法上样，进行硅胶柱层析。

45、具体地，步骤s4中，所述进行硅胶柱层析的具体操作为：将步骤3所得流份a按照质量比为1:1与硅胶(200～300目)充分混合研磨，干法装柱，干法上样，进行硅胶柱层析。

46、本发明还保护所述龙眼果肉提取物在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂或阿尔兹海默症防治药物中的应用。

47、本发明还保护一种乙酰胆碱酯酶抑制剂或阿尔兹海默症防治药物，以所述龙眼果肉提取物为活性成分。

48、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

49、本发明首次从龙眼果肉中提取分离得到两个具有抑制乙酰胆碱酯酶活性的龙眼果肉生物碱类化合物，对其进行了活性研究，实验数据表明，该龙眼果肉生物碱类化合物具有乙酰胆碱酯酶的活性的作用，能阻止乙酰胆碱酯酶降解乙酰胆碱，增加直接参与认知功能障碍的乙酰胆碱的含量水平，说明其能够用于制备乙酰胆碱酯酶抑制剂和阿尔兹海默症防治药物。

50、基于此本发明提供的龙眼果肉提取物成分更加简单、纯度高，主要含有化合物1和/或化合物2，在开发为乙酰胆碱酯酶抑制剂以及阿尔兹海默症防治药物方面具有很重要的应用价值。