一种具有超广谱裂解活性的裂解酶LysPd403及其应用

本发明涉及生物制剂领域，具体涉及一种具有超广谱裂解活性的裂解酶lyspd403及其应用。

背景技术：

1、牙周炎是一种由牙周致病菌引起的牙周支持组织慢性炎症，是最常见的口腔疾病之一，不仅影响牙周组织、诱导牙槽骨吸收导致牙齿脱落，严重还会影响全身健康。研究显示，牙周炎与口腔菌群息息相关，口腔菌群发生紊乱，就会引发口腔感染从而导致炎症。

2、牙周炎的基础治疗主要以机械的手段去除牙石、菌斑等局部刺激因素，然而单纯的机械治疗并不能彻底清除患处的菌斑，治疗后的位点短期内会发生牙周致病菌的再定植，且操作困难，易引起的反抗，存在一定的局限性。另外可以辅助局部或全身药物治疗，如采用阿莫西林、头孢氨苄、甲硝唑等抗生素类药物消除牙周致病菌，然而定期使用抗生素会导致口腔耐药菌株的产生。噬菌体是一种特异性感染细菌的病毒，是口腔微生态的重要组成部分，具有专一高效的杀菌能力，噬菌体疗法有望作为牙周辅助治疗的新策略。

3、噬菌体裂解酶是噬菌体产生的一种肽聚糖水解酶，当与靶细菌接触时可以快速水解其细胞壁中的肽聚糖成分而使细菌迅速裂解死亡。噬菌体裂解酶具有高度宿主特异性和强烈裂解活性，能识别并攻击宿主细胞壁的特定靶位点，导致细胞壁的局部破坏，最终使噬菌体颗粒从细菌细胞中释放出来。噬菌体裂解酶高度的特异性使其可针对特定的病原菌进行有效的治疗，而不会对其他微生物造成影响。近年来，噬菌体裂解酶作为一种新型的抗菌剂，被证实在体内外均有显著的杀菌作用，同时其生物膜清除能力也十分显著。由于裂解酶对其宿主细菌耐药可能性低、安全水平高和易于设计的独特优势，裂解酶被视为抗生素的有效替代品，现已被广泛应用于生物和医药等领域。

4、cn116555230a本发明公开了一种肠炎沙门菌噬菌体裂解酶、制备方法及应用。该发明制备得到的肠炎沙门菌噬菌体裂解酶对不同来源不同血清型的沙门菌和大肠杆菌均有较高的裂解活性，对沙门菌及大肠杆菌表现出广谱杀菌活性，可以高效裂解不同来源不同血清型的沙门菌和大肠杆菌，有助于预防和治疗沙门菌及大肠杆菌所引起的疾病。

5、cn116355887a公开了一种链球菌前噬菌体裂解酶lys733及其应用。该发明发明从乳房链球菌hb-4基因组中克隆得到链球菌前噬菌体裂解酶lys733，采用原核表达方式，诱导表达出可溶的裂解酶。该发明所提供的链球菌前噬菌体裂解酶lys733对链球菌属内可致奶牛乳腺炎的无乳链球菌和停乳链球菌具有较为特异的抑菌效果，为预防和治疗无乳链球菌和停乳链球菌细菌感染的疾病奠定了基础。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种具有超广谱裂解活性的裂解酶lyspd403。本发明提供的具有超广谱裂解活性的裂解酶lyspd403在体外对牙龈卟啉单胞菌，具核梭杆菌，伴放线放线聚集杆菌，粪肠球菌、变形链球菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌具有较好的裂解效果，能广谱裂解革兰氏阴性菌和阳性菌。

2、一种具有超广谱裂解活性的裂解酶lyspd403，所述裂解酶lyspd403氨基酸序列如seq id no.1所示。

3、mtaleqldyvkkyfeplrgkkvefidfylqvlfpassmksehivfaksmklltstnekdtlkklrviayeqnrgldsnkdgviwkseidkkvqiymtkglaykenkfvcdktptsaktptsksvhpivslirkweyysgenatsstigefyvsddpsihgfiaepygpssiqsgqdkripvgeynlrwyisstygknkykkkniilkngfpnvynenvsaqrgilihignfgkdtvgcllpgnglmkrtingkevivgvsdsagafvklidyleskgienvklvisenyekidk(seq id no.1)。

4、优选的，所述裂解酶lyspd403的基因序列如seq id no.2所示。

5、atgacggccctggaacagctggattatgttaaaaaatactttgaaccgctgcgtggtaaaaaagttgaattcattgacttctatctgcaggtgctgttcccggcatcgagcatgaaatcagaacacatcgttttcgcgaaatcaatgaaactgctgacctcaaccaatgaaaaagataccctgaaaaaactgcgcgttattgcctacgaacagaatcgtggcctggattcgaacaaagacggcgttatctggaaaagcgaaatcgacaaaaaagtgcagatctatatgaccaaaggtctggcgtataaagaaaataaattcgtttgtgacaaaacgccgaccagcgcaaaaaccccgacgtcgaaatcagttcacccgatcgtgtcactgattcgcaaatgggaatattattcaggcgaaaatgcgacgtcaagcacgattggcgaattttatgtttcggacgatccgtcaatccacggcttcattgcggaaccgtatggtccgagcagcattcagagcggccaggataaacgtattccggtgggtgaatataacctgcgttggtatatttcatcaacctacggcaaaaacaaatacaaaaaaaaaaatatcattctgaaaaatggttttccgaacgtttacaacgaaaacgtttcagcccagcgcggtatcctgattcatatcggtaattttggcaaagacaccgtgggctgcctgctgccgggtaatggcctgatgaaacgtacgattaatggtaaagaagtgattgtgggtgtgtcagacagcgcaggtgcgttcgtgaaactgatcgactacctggaatcgaaaggcattgaaaatgttaaactggttatcagcgaaaactacgaaaaaattgacaaa(seq id no.2)。

6、本发明提供了上述的超广谱裂解活性的裂解酶lyspd403的制备方法，包括如下步骤：

7、(1)、构建表达所述超广谱裂解活性的裂解酶的重组表达载体；

8、(2)、将步骤(1)中的重组表达载体转化入大肠杆菌感受态细胞，筛选得到表达所述超广谱裂解活性的裂解酶lyspd403基因的工程菌；

9、(3)、对步骤(2)所得工程菌进行诱导表达，获得重组基因表达产物；

10、(4)、将步骤(3)所得重组基因表达产物经镍柱纯化分离，再用hepes缓冲液透析处理，得到所述超广谱裂解活性的裂解酶lyspd403。

11、优选的，所述步骤(1)中的重组表达载体为原核表达载体pet28b-lyspd403。

12、优选的，所述步骤(2)中的大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌bl21(de3)。

13、优选的，所述步骤(3)中诱导表达所用的诱导剂为异丙基β-d-硫代半乳糖苷，诱导浓度为0.3-0.5mmol/l，诱导时间为14-16h，诱导表达温度为15-20℃。

14、本发明还提供了上述具有超广谱裂解活性的裂解酶lyspd403在裂解革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中的应用。

15、优选的，所述革兰氏阴性菌为牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、伴放线放线聚集杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌。

16、优选的，所述革兰氏阳性菌为粪肠球菌、变形链球菌。

17、本发明还公开了上述具有超广谱裂解活性的裂解酶lyspd403在口腔抗感染药物中的应用。

18、牙龈卟啉单胞菌，porphyromonas gingivalis，是一种革兰氏阴性细菌，是慢性牙周炎病变部位最主要的优势菌之一，参与牙周炎的发病机制，也是目前公认的牙周致病菌。虽然牙龈卟啉单胞菌在口腔微生物群中的丰度较低，但它可以与其他微生物协同作用，破坏宿主微生物群的稳态、诱导牙周组织的炎症反应并抑制宿主清除病原菌。

19、具核梭杆菌，fusobacterium nucleatum，是一种革兰氏阴性厌氧菌，是牙周炎龈上菌斑、龈下菌斑和牙周袋等感染部位丰度最高的梭杆菌。它主要寄居在牙周袋和口腔黏膜表面，形成生物膜并产生多种毒力因子，从而引起牙周炎、口腔感染等疾病，研究表明，具核梭杆菌的检出率与牙周组织的病变以及破坏程度成正相关，它是牙周致病菌“第二复合体”，与牙周炎紧密相关的核心细菌。

20、伴放线放线聚集杆菌，actinomyces israelii，是一种革兰氏阳性细菌，是会侵袭牙周组织，引起牙周炎的一种细菌。在口腔感染中，伴放线放线聚集杆菌常会产生许多毒力因子，从而导致白细胞死亡，让溶酶体释放，这时就会对牙周组织造成很严重的破坏，出现牙周炎等疾病。

21、鲍曼不动杆菌，acinetobacter baumannii，是一种革兰氏阴性细菌，是一种常见的机会致病菌。鲍曼不动杆菌具有较强的生物膜形成能力，能够在牙齿表面、口腔黏膜等部位形成生物膜，从而抵抗口腔中的免疫系统和抗菌药物的攻击。此外，它还能够产生多种毒力因子，如细胞毒素、溶血毒素等，对口腔组织造成破坏，可引起口腔感染，如口腔溃疡、口腔炎症、牙周炎等。

22、铜绿假单胞菌，pseudomonas aeruginosa，又称绿脓杆菌，是一种革兰氏阴性细菌。铜绿假单胞菌是一种常见的条件致病菌，它可以引起人体各个部位的感染，包括口腔感染。当口腔黏膜破损或口腔卫生不良时，铜绿假单胞菌就有机会进入口腔，产生多种毒力因子，对口腔组织造成破坏和感染，从而导致口腔溃烂，可以引起牙龈炎、牙周炎等口腔疾病，导致牙齿疼痛、松动、脱落等症状。

23、粪肠球菌，enterococcus faecalis，是一种革兰氏阳性细菌，通常存在于哺乳动物的肠道和口腔中。粪肠球菌容易在牙齿表面形成菌斑，从而导致龋齿和牙周炎。这是因为粪肠球菌能够利用食物残渣中的糖分进行代谢，产生酸类物质，腐蚀牙齿表面，引发龋齿和牙周炎。

24、变形链球菌，streptococcus mutans，是一种革兰氏阳性细菌，主要存在于人类口腔中，是龋齿和牙周炎的主要病原体之一。变形链球菌通过分泌一些黏附因子和产生具有破坏性的毒素，黏附在牙齿表面和牙间隙中，形成生物膜，定植在口腔中，同时所产生的毒素能够刺激牙龈组织释放一些炎症因子，导致局部炎症反应，细菌在口腔中长期存在并持续感染，进而引发牙周炎。

25、本发明的有益效果：

26、与现有技术相比，本发明提供了一种具有超广谱裂解活性的裂解酶lyspd403，该裂解酶lyspd403在体外对牙周炎疾病相关致病菌，如牙龈卟啉单胞菌，具核梭杆菌，伴放线放线聚集杆菌，粪肠球菌、变形链球菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌具有较好的裂解效果，能广谱裂解革兰氏阴性菌和阳性菌，为预防和治疗上述细菌感染的疾病奠定了基础。同时，裂解酶lyspd403能在大肠杆菌中进行可溶性表达，酶的活性高，因此，该裂解酶lyspd403在抗感染药物的研发中具有较好的应用前景。

27、采用本发明提供的具有超广谱裂解活性的裂解酶lyspd403作为活性成分所制备的抗感染相关药物副作用小，对于治疗牙周炎的疗效明显，且使用方便，适合推广。