一种ETV2的ORF序列以及一种内皮细胞的制备方法

本发明涉及内皮细胞开发，尤其涉及一种etv2的orf序列以及一种内皮细胞的制备方法。

背景技术：

1、内皮细胞（endothelial cells，ecs）是构成血管和淋巴管的重要组成部分。ecs参与并调节多个生物学过程，如器官和组织间的互作，血管对外周血中物质的通透性，组织的血液灌注情况，炎症的发生发展以及血栓的形成。ecs的功能紊乱会导致凝血-纤溶平衡的失调，进而使血管内形成血栓，阻碍了血液流动，最终导致组织的缺血坏死，严重影响患者的生活质量。若梗阻部位位于脑血管或冠状动脉，则患者有梗死风险。因此，如何促使血管再通，恢复组织灌注是解决缺血性疾病的关键。

2、目前临床常用的治疗缺血性疾病的方法为溶栓或支架治疗，但由于ecs自身的功能紊乱未得到改善，部分患者治疗后出现再次梗阻，疗效不佳。干细胞技术近年来的发展为缺血性疾病的治疗提供了新的方案。通过将干细胞来源的内皮细胞（stem-cell-derivedendothelial cells，sc-ecs）直接注射到缺血部位，能够有效促进血管新生，改善组织灌注情况。但如何在体外细胞培养中安全高效地将干细胞分化为内皮细胞仍是领域内亟待解决的问题。

3、现有技术公开了转录因子e26转化-特异性变体2（e26 transformation-specificvariant 2，etv2）在内皮谱系分化中发挥着至关重要的作用，其作为先驱转录因子，具有将体细胞及多能干细胞重编程为内皮细胞的能力。研究表明，在小鼠胚胎成纤维细胞和人多能干细胞中过表达etv2能成功分化出ecs，持续表达7天后分化效率近100%。显然，etv2过表达分化内皮细胞的策略在分化效率上具有独到的优势。但通过何种方式实现etv2的过表达仍是值得考虑的问题。

4、中国专利cn 115515608a公开了一种利用腺病毒/慢病毒作为载体的方法，使etv2基因转入小鼠体内，实现重编程，进而形成内皮细胞和血管。但该方法是通过体外改造腺病毒/慢病毒并使其转导目标细胞，将病毒所携带的核酸随机整合到宿主基因组上实现基因的过表达，其随机整合的特性会带来诸多不可预测的风险。同时，尽管病毒经过了体外改造，但是其生物学行为本身仍对人体有着潜在危害，故难以应用于临床细胞治疗。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种etv2的orf序列，能够高效表达etv2蛋白，用于将干细胞分化为内皮细胞能够显著提升转化效率。

2、本发明提供的内皮细胞的制备方法，制备效率高、且临床应用风险较低。

3、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

4、本发明提供了一种etv2的orf序列，所述orf序列如seq id no.1所示。

5、本发明还提供了一种转录etv2 mrna的重组载体，所述重组载体包含初始载体和上述orf序列。

6、优选的，所述重组载体还包含5’utr调控序列和3’utr调控序列；

7、所述5’utr调控序列如seq id no.3所示；

8、所述3’utr调控序列如seq id no.4所示。

9、优选的，所述初始载体为初始载体为质粒puc57。

10、本发明还提供了上述orf序列或上述重组载体在制备内皮细胞中的应用。

11、本发明还提供了一种过表达etv2的方法，包括以下步骤：

12、将上述重组载体进行体外转录，得到etv2 mrna；

13、将etv2 mrna导入受体细胞，诱导表达，实现etv2的过表达。

14、优选的，采用电转法将etv2 mrna导入受体细胞。

15、本发明还提供了一种内皮细胞的制备方法，包括以下步骤：

16、将上述orf序列构建至初始载体中，得到重组载体；

17、将所得重组载体进行体外转录，得到etv2 mrna；

18、将etv2 mrna导入中胚层细胞，进行分化培养，得到内皮细胞。

19、本发明还提供了通过上述制备方法得到的内皮细胞。

20、本发明还提供了上述内皮细胞在制备血管生成促进剂中的应用。

21、本发明的有益效果：

22、本发明提供了一种etv2的orf序列，用于翻译能够得到更多的etv2蛋白，表达效率更高。

23、本发明提供的内皮细胞制备方法采用了体外mrna制备及mrna转染技术，能够高效快速地实现内皮细胞的大量制备。制备方法中获得的etv2 mrna大小仅有1-2kb，导入中胚层细胞的效率接近100%。etv2 mrna导入中胚层细胞后表达时间较长，能够满足细胞命运重编程和内皮分化的需求。本发明提供的制备方法为内皮细胞直接注射到缺血部位、促进血管新生、改善组织灌注情况提供了稳定的细胞来源。

技术特征：

1.一种etv2的orf序列，其特征在于，所述orf序列如seq id no.1所示。

2.一种转录etv2 mrna的重组载体，其特征在于，所述重组载体包含初始载体和权利要求1所述的orf序列。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体还包含5’utr调控序列和3’utr调控序列；

4.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述初始载体为质粒puc57。

5.权利要求1所述的orf序列或权利要求2~4任一项所述的重组载体在制备内皮细胞中的应用。

6.一种过表达etv2的方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的过表达etv2的方法，其特征在于，采用电转法将etv2 mrna导入受体细胞。

8.一种内皮细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

9.通过权利要求8所述的制备方法得到的内皮细胞。

10.权利要求9所述的内皮细胞在制备血管生成促进剂中的应用。

技术总结
本发明提供了一种ETV2的ORF序列以及一种内皮细胞的制备方法，属于内皮细胞开发技术领域。本发明中ETV2的ORF序列如SEQ ID NO.1所示，能够高效表达ETV2蛋白，用于翻译能够得到更多的ETV2蛋白，表达效率更高，用于将干细胞分化为内皮细胞能够显著提升转化效率。本发明提供的内皮细胞的制备方法，制备效率高、且临床应用风险较低。因此解决了现有技术中无法安全高效地将干细胞分化为内皮细胞的问题。本发明能够高效快速地实现内皮细胞的大量制备，满足细胞命运重编程和内皮分化的需求。本发明提供的制备方法为内皮细胞直接注射到缺血部位、促进血管新生、改善组织灌注情况提供了稳定的细胞来源。

技术研发人员：王凯,潘子航,王茜,朱舜天,于洋,乔杰
受保护的技术使用者：北京大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15